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食品及饮料行业

婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验解决方案

我公司针对目前乳制品行业及质量监测单位检验阪崎肠杆菌的需求及情况，对阪崎肠杆菌检验相应的技术改进，使得阪崎肠杆菌检出率较之前有很大的改进。扩充并完善了相关的微生物检测试剂，使得技术操作人员能更准确、快捷的检测出目标菌。

方案一：传统微生物检测法

依据GB 4789.40-2016食品卫生微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验，推出成套的阪崎肠杆菌检验解决方案，为生产企业及检验单位提供方便。

第一法克罗诺杆菌属定性检验操作步骤

1.1 前增菌和增菌取检样100 g（mL）加入已预热至44 ℃装有900 mL 缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36 ℃±1 ℃培养18 h±2 h。移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤，44 ℃±0.5 ℃培养24 h±2h。

1.2 分离 1.2.1 轻轻混匀mLST-Vm 肉汤培养物，各取增菌培养物1 环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。 1.2.2 挑取至少5个可疑菌落，划线接种于TSA 平板。25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。

1.3 鉴定自TSA 平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。克罗诺杆菌属的主要生化特征见表2。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。

克罗诺杆菌属的主要生化特征

生化试验		特征
黄色素产生		+
氧化酶		-
L-赖氨酸脱羧酶		-
L-鸟氨酸脱羧酶		（+）
L-精氨酸双水解酶		+
柠檬酸水解		（+）
发酵	D-山梨糖	（-）
	L-鼠李糖	+
	D-蔗糖	+
	D-蜜二糖	+
	苦杏仁甙	+
注：+＞99%阳性： -＞99%阴性；（+）90%-99%阳性；（-）

1.4 结果与报告综合菌落形态和生化特征，报告每100 g（mL）样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。

第二法克罗诺杆菌属的计数操作步骤

2.1 样品的稀释 2.1.1 固体和半固体样品：无菌称取样品100 g、10 g、1 g 各三份，加入已预热至44 ℃分别盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，轻轻振摇使充分溶解，制成1:10 样品匀液，置36 ℃±1 ℃培养18 h±2 h。分别移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤，44 ℃±0.5 ℃培养24 h±2 h。 2.1.2 液体样品：以无菌吸管分别取样品100 mL、10 mL、1 mL 各三份，加入已预热至44 ℃分别盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，轻轻振摇使充分混匀，制成1:10 样品匀液，置36 ℃±1 ℃培养18h±2h。分别移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤，44 ℃±0.5 ℃培养24 h±2 h。

2.2 分离、鉴定同1.2，1.3。

2.3 结果与报告综合菌落形态、生化特征，根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数，查MPN 检索表，报告每100 g（mL）样品中克罗诺杆菌属的MPN 值（见国标附录Ｂ中表B.1）。

实验操作所用培养基及生化试剂

功能阶段	实验序号	产品序号	产品名称	规格	类别
前增菌	1	023130	缓冲蛋白胨水（BPW）	250g	瓶（干粉）
前增菌	1	CP0560A	缓冲蛋白胨水（BPW）	9 ml×20支	盒（管装）
增菌	2	022212	改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤基础（MLST）	250g	瓶（干粉）
		SR0180	万古霉素（改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤配套试剂）每支添加于100 ml基础培养基中	1 ml×10支	盒（西林瓶）
		CP0750	改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（MLST-Vm）	10 ml×20支	盒（管装）
平板分离	3	CRM006	阪崎肠杆菌显色培养基（DFI）	1000 mL	瓶（干粉）
平板分离	3	CRM006B	阪崎肠杆菌显色培养基（DFI）	90mm×20	盒（平板）
生化鉴定	4	024072	胰蛋白胨大豆琼脂培养基(大豆消化酪素琼脂培养基)TSA	250g	瓶（干粉）
	4	024079	胰蛋白胨大豆琼脂培养基(大豆消化酪素琼脂培养基)TSA	90mm×20	盒（平板）
	5	029170	氧化酶试纸	10片/盒	盒
	6	075280	L-赖氨酸脱羧酶培养基	20支	盒（西林瓶）
	6	075290	氨基酸脱羧酶对照	20支	盒（西林瓶）
	7	075270	L-鸟氨酸脱羧酶培养基	20支	盒（西林瓶）
	8	075590	L-精氨酸双水解酶培养基	20支	盒（西林瓶）
	8	075600	精氨酸双水解酶对照	20支	盒（西林瓶）
	9	029110	无菌液体石蜡	10 mL×1支	瓶
	10	075090	D-山梨醇	20支	盒（西林瓶）
	11	075110	L-鼠李糖	20支	盒（西林瓶）
	12	075050	D-蔗糖	20支	盒（西林瓶）
	13	075560	D-蜜二糖	20支	盒（西林瓶）
	14	022120	西蒙氏柠檬酸盐培养基	250 g	瓶（干粉）
	15	071870	阪崎肠杆菌生化鉴定盒	11种×10支	盒（西林瓶）

不同培养基下菌种显现出不同的菌落形态（菌株：阪崎肠杆菌 ATCC29544）

培养基：TSA 培养基：阪崎肠杆菌显色培养基DFI

方案二：恒温荧光快速检测法

基于核酸水平的快速检测技术目前日臻发展成熟，不少分子检测技术已经写入标准当中，比如PCR、LAMP技术；我司推出基于恒温荧光检测技术的微生物快速试剂盒，可用于食源性致病菌，包括阪崎肠杆菌。该试剂盒无需常规PCR中变性、退火、延伸等步骤不同温度设计要求，只需提供一个适宜的恒定温度即可。因此，与常规PCR相比，恒温荧光检测技术更适合现场高通量快速检测，具有简单、快速、特异性强的特点。

操作流程图

所需试剂、仪器及耗材列表

产品名称	规格	备注
阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）	24test/盒	详见“产品信息1”
缓冲胨水增菌液BPW	250g/瓶
移液枪、枪头	1-10 μL、10-200 μL和100-1000 μL各一把	枪头推荐国产枪头即可。
离心机	最大转速不低于12,000 rpm，离心机转子支持200 μL和1.5 mL离心管离心。	详见“产品信息2”
恒温金属浴	——	详见“产品信息3”