支原体的培养法检测详细介绍！
发布时间：2023-12-06 浏览次数：351
支原体是细胞培养过程中常见的外源性污染物，对于生物制品生产企业来说，支原体污染是非常严重的问题，给生物制品带来难以估量的安全隐患。因此，开展支原体检查是细胞质量控制微生物学安全性评价体系中的一项重要内容。针对支原体对细胞培养带来的巨大不良影响，在中国药典、美国药典、欧洲药典和日本药典中都要求，对主细胞库、工作细胞库、病毒种子批以及病毒疫苗等执行支原体检查。
01 目前有哪些常见的检测方法？
常见的支原体检测方法
培养法和指示细胞培养法则是被各国药典普遍认可的、用于生物制药的质控的支原体检测方法。然而，培养法所使用的培养基并不能适用所有的支原体生长，存在一定的局限性，同样指示细胞培养法对于一些胞质吸附能力较弱的支原体检出也会存在一定的局限性。因此，药典中要求对支原体检测需要两种方法共同检测，以确保支原体检出的效力。
02 直接培养法
《中华人民共和国药典》规定的支原体检测方法培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）是检测支原体的“金标准”，能够检测不同生长特性的支原体。下面我们详细介绍一下直接培养法。
1) 不同培养基
由于支原体DNA中缺少编码中间代谢产物的基因, 支原体的能量代谢系统比较简单，因此支原体具有“营养缺陷”的特点，许多重要代谢途径受阻，如三羧酸循环、糖异生等。这使得支原体生长对营养的需求比一般细菌要高，生长所需的营养成分主要从外界摄取，除需要含有碳源、氨基酸、无机盐等基础营养物质外，还需加入人或动物血清，以提供支原体生长、繁殖所必需的胆固醇和脂肪酸。
● 根据支原体是分解葡萄糖还是利用精氨酸，支原体培养基可以分为2类，即葡萄糖发酵型和精氨酸水解型。解脲支原体虽然不能利用葡萄糖或精氨酸，但可以利用精氨酸水解生成的尿素。
● 根据培养基中是否有琼脂及其含量又可分为液体、半流体与固体培养基。
2) 不同培养法
● 液体培养基培养法：在富含葡萄糖的支原体肉汤培养基中，支原体分解葡萄糖产生酸性物质，从而使液体培养基pH值下降为酸性，颜色变黄；精氨酸支原体肉汤培养基pH值为碱性，支原体生长可分解尿素，产生氨，会使得pH进一步变高，培养基颜色变为桃红色，提示有支原体生长；
● 半流体培养基培养法：在半流体培养基中如观察到沿接种线呈烟雾状，则提示有支原体生长；
● 固体培养基培养法：在固体琼脂培养基上，可观察到支原体形成经典的“油煎荷包蛋”式的菌落，通过观察菌落形态以判断是否存在支原体污染。
操作规范的情况下，直接培养法不容易出现假阴性结果，检测精确度很高，因此被誉为支原体检测金标准。缺点是检测周期太长，支原体要长出明显克隆至少需要28天时间，对于放行周期要求比较苛刻的生物制品如CAR-T细胞治疗产品，该方法会带来实际应用上的挑战。
03 直接培养法的特点
优点：在选用合适培养基以及合规要求操作下，很少会出现假阴性结果，检测精确度很高，因此被誉为支原体检测金标准。
缺点：操作时间太长，至少28天才能出结果，满足不了大多数质检部门的要求。无法检测出死亡的支原体。
来源：环凯转载于“ 恒驭生物 ”公众号，作者~海芋。
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