【学习笔记】GB 5749生活饮用水微生物指标——菌落总数解读
发布时间：2024-02-21 浏览次数：512
GB5749-2022 规定的常规检验微生物指标共3项，总大肠菌群、大肠埃希氏菌、菌落总数。
其中水中菌落总数可作为评价水质清洁程度和考核净化效果；大肠菌群指示水体是否存在肠道传染病的可能性。
总大肠菌群主要包括4个菌属：埃希氏菌属、柠檬酸菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属。这些菌属可以在人、畜粪便中检出，有的也可以在营养丰富的水体中检出，即在非粪便污染的情况下，也有检出这些细菌的可能性。耐热大肠菌群和总大肠菌群组成相同，但主要组成是埃希菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希氏菌。柠檬酸菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属所占数量较少。作为粪便污染的指示菌，大肠埃希氏菌检出的意义最大，其次是粪大肠菌群，总大肠菌群的卫生学意义稍逊一些。
PART.1 检测依据
1、GB/T 5750.2-2023《生活饮用水标准检验方法 第2部分：水样的采集与保存》
2、GB/T 5750.12-2023《生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》
PART.2 水样采集
一、采样容器：洁净磨口硬质玻璃瓶；洁净聚乙烯瓶（桶或袋）；也可以使用符合要求的一次性采样袋或采样瓶。
二、采样容器的洗涤
1. 容器洗涤：将容器用自来水和洗涤剂洗涤，并用自来水彻底冲洗后用质量分数为10%的硝酸（或盐酸）浸泡8h以上，然后依次用自来水和纯水洗净。
2. 容器灭菌：可采用干热或高压蒸汽灭菌两种。干热灭菌要求160℃下维持2h；高压蒸汽灭菌要求121℃下维持15min，高压蒸汽灭菌后的容器如不立即使用，应置于60℃烘箱内将瓶内冷凝水烘干。灭菌后的容器应在2周内使用。
三、采样要求
1. 无菌操作。
2. 不应用水样荡洗已灭菌的采样瓶或采样袋 。
3. 避免手指和其他物品对瓶口或袋口的玷污。
4. 自来水水样：先将水龙头用火焰烧灼3min灭菌再开放水龙头使水流5min（经常用水的水龙头放水1-3min）后，采集水样。
5. 水源水水样：选有代表性的地点及可疑地方，一般距水面下10-15cm采集，采样后在水中盖好盖子，再从水中取出。
6. 从速送检，在0~4℃下保存，水样从采集到检验不应超过8h。
PART.3.1 项目测定：菌落总数
一、概念
1. 菌落：指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。
2. 菌落总数：在一定条件下，经一定时间培养后所得1mL水样中微生物菌落个数。
二、意义
1. 水中菌落总数可作为评价水质清洁程度和考核净化效果的指标。
2. 菌落总数增多说明水体已被污染，但不能说明污染来源，也不能说明该水体传播传染病的风险程度。因此，必须结合总大肠菌群来判断水质污染的来源和安全程度。
三、测定方法 —— 平皿计数法
1. 原理：1mL水样在营养琼脂培养基上、在有氧条件下36℃±1℃培养48h后，所得1mL水样中的菌落总数的方法。
2. 营养琼脂培养基
成分：蛋白胨10g；牛肉膏3g；氯化钠5g；琼脂10~20g；纯水1000mL
制法：将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4~7.6，分装于玻璃容器中，经121℃高压蒸汽灭菌20min，0~4℃冷藏保存。
3. 实验步骤
生活饮用水：
① 以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取1mL充分混匀的水样，注入无菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀，每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
② 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培养箱内培养48h±2h，进行菌落计数，即为1mL水样中的菌落总数。
水源水：
① 以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，混匀成1：10稀释液；
② 用无菌吸管或移液器吸取1：10的稀释液1mL注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，混匀成1：100稀释液；
③ 按同法依次稀释成1：1000、1：10000等稀释度的液体备用。每稀释一个稀释度，应更换一次1mL无菌吸管或吸头。
④ 用无菌吸管或移液器吸取2个~3个适宜稀释度的水样1mL，分别注入无菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。
4. 实验数据处理
结果报告：可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
同一稀释度，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数；若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后×2以代表全皿菌落数。然后再求得该稀释度的平均菌落数。
不同稀释度的选择及报告方法，见下表。
四、测定方法——酶底物法
1. 原理：利用复合酶技术，在培养基中加入多种独特的酶底物，每一种酶底物都针对不同的细菌酶设计，且包含最常见的介水传播的细菌，所有的酶底物在被分解时均产生相同的信号。水样检测过程中，水样中存在的细菌分解一种或者多种酶底物，之后产生一个相同的信号，在检测菌落总数时，这个信号即为在波长366 nm紫外灯下所产生的荧光。使用基于复合酶底物技术(Multiple Enzyme Technology)的培养基，其中酶底物被微生物的酶水解，在36℃±1℃下培养48 h后能够最大限度地释放4-甲基伞形酮，4-甲基伞形酮在366 nm紫外灯照射下发出蓝色荧光，对呈现蓝色荧光的培养盘孔槽计数并查阅MPN表，可以确定原始水样中最可能的菌落总数。
本方法未稀释水样的检测范围为<738 MPN/mL。
2. 复合酶底物培养基
成分：a)葡萄糖 1.25g、b)无水硫酸镁 0.2g、c)蛋白胨 5.0g、d)酵母提取物 3.5g、e)4-甲基伞形酮磷酸酯 0.0375g、f)4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷 0.03g、g)纯水 1000mL。
制法：将上述成分溶解于纯水中，调整pH为6.7～7.3，经0.22um滤膜过滤除菌。制备好的培养基于2℃~8℃条件下保存备用。
3. 实验步骤
水样稀释：检测所需水样为1 mL。若水样污染严重，可对水样进行稀释。以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取1 mL充分混匀的水样，注入盛有9 mL无菌生理盐水的试管中，充分振荡混匀后取1 mL进行检测，必要时可加大稀释度，以10倍逐级稀释。
接种培养：
① 向一无菌试管中加入9 ml制备好的液体培养基；如选用符合要求的成品培养基，则向装有0.1 g培养基的试管中加入9 mL无菌生理盐水。取1 mL水样加入上述试管中，涡旋振荡混匀。
② 将混匀后的水样倒入培养盘中心位置，将培养盘盖好，放置在水平桌面上，紧贴桌面顺时针轻柔晃动培养盘，将待测水样分配到培养盘的所有孔槽中。
③ 将培养盘90°~120°竖起，使多余的水样由盘内海绵条吸收，将培养盘缓慢翻转过来，倒置放于36 ℃±1℃培养箱中，培养48 h。可叠放培养，不宜超过10层。
4. 实验数据处理
结果计数：将培养后的培养盘取出，倒置于暗处或紫外灯箱内，在6 W 366 nm紫外灯下约13 cm处观察，记录产生蓝色荧光的孔数。如未放置在紫外灯箱内，观察时需佩戴防紫外线的护目镜。培养盘中的84个孔，无论荧光强弱，只要呈现蓝色荧光即为阳性，但海绵条的荧光不计入结果。
结果报告：根据显蓝色荧光的孔数，对照表⒉查出孔数对应的每毫升样品中的菌落总数的MPN值。如果样品进行了稀释，读取的结果应乘以稀释倍数并报告之，结果以MPN/mL表示。如果所有孔均未显荧光，则可报告为菌落总数未检出。
不同稀释度的选择及报告方法
选择菌落总数在<738 MPN/mL. 范围内的稀释度，如果只有一个稀释度的结果符合此范围，则将结果乘以稀释倍数报告结果。
若有两个或两个以上稀释度的结果均落在<738 MPN/mL. 范围内，则选择稀释度最小的结果乘以稀释倍数报告结果。
若所有稀释度的培养盘上均无蓝色荧光，则以未检出报告结果。
五、指标限值
菌落总数 :100MPN/mL或CFU/mL，(小型集中式供水和分散供水因水源与净水技术受限时，菌落总数指标限值按500MPN/mL或CFU/mL执行）。
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