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2×pEC-T vector Fast Ligation Mix(规格:20次×5 | 货号:HKT006-01B)

英文名称:2×pEC-T vector Fast Ligation Mix

货 号 :HKT006-01B

规 格 :20次×5

用途:T载体

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产品名称:2×pEC-T vector Fast Ligation Mix

产品编号与包装规格:

编号产品名称规格产品介绍价格
HKT006-01B2×pEC-T vector Fast Ligation Mix20次×5T载体2398

产品描述:
      Easy Cloning T-vector 是一种PCR产物高效TA克隆的专用T载体。它由pBluescript II KS 载体改造而成:保留了pBluescript II KS 载体全部的酶切位点;PCR 产物插入位点处于多克隆酶切位点的中间,其两侧都有众多的酶切位点可供选择。
      传统 T 载体在进行连接时的操作程序是:载体、片段、T4 DNA Ligase Buffer、T4 DNA Ligase。本制品是在传统模式上将除了插入片段的各成分进行预混,并使其在稳定性、转化子数目、阳性率方面不低于传统模式,使用时只需加入插入片段即可,大大简化了操作过程,降低了配制连接体系过程中的误差和污染率,节省了时间。

产品特点:
      高效:快速连接,15 分钟即可完成连接反应。
      稳定:-20℃取出反复冻融 20 次,克隆数目及阳性率不受影响。
      快捷:只需加入插入片段再补充去热源水到 10μL 体系。

使用建议:
      1)连接使用的 PCR 片段 3'端应带有 A 末端,如果是使 用 pfu 等高保真聚合酶扩增的不带 A 末端的平末端片段, 不可直接用于进行连接反应。
      2)克隆时使用的 Insert DNA 片段(PCR 产物)建议进行切胶回收纯化,否则 PCR 产物中的短片段 DNA、残留引物等杂质都会影响 TA 克隆效率。
      3)转化过程中建议使用Control Insert DNA做对照,以便在实验出现问题时确定原因。

保存温度:-20℃

2×pED-T vector Fast Ligation Mix 产品包装(A包装):

2×pSC-T vector Fast Ligation Mix 产品包装(A包装)

质量保证:
   Control Insert 克隆后的白色菌落中,有 90% 以上含有 Insert DNA 片段。 
   Control Insert 经克隆后,经测序确认''T''突出的存在。

操作方法:

1) 快速连接反应体系:

组分体积
2×pEC-T vector Fast Ligation Mix (10 ng/μL)10μL
目的PCR 片段/ Control Insert DNAX μL/1μL
ddH2O至 20μL

反应条件:16℃或 25℃下,保温15至30分钟。
      注:保温5分钟也能正常进行连接反应,但反应效率略为降低。25℃下进行连接,其效果略差于16℃下连接效果。而更高的温度(>26℃)则较难形成环状DNA。

2) 取10μL加入至100μL感受态细胞中,用移液枪吹打混合,冰上放置30分钟。 
3) 将离心管置于42℃水浴中,热激60-90秒,迅速将离心管置于冰上,放置2-3分钟。 
4) 向每个离心管中加入500μL无菌不含抗生素的LB或SOC培养基中,37℃摇床,150rpm振荡培养45分钟,使质粒上氨苄抗性基因表达,菌体复苏。
5)吸取 200μL 已转化的感受态细胞,加到含氨苄青霉素的 LB 或SOC 固体平板上,用无菌涂布棒将细胞均匀涂开,将平板置于 37℃培养箱里直至液体完全吸收,倒置培养 12-16 小时。 
6) PCR 检测,利用试剂盒自带高速 PCR 扩增试剂 2×FastTaq Mast Mix 直接进行菌落PCR 鉴定。

pEC-T 结构图

f1 (+) origin135–441
LacZ alpha fragment451–832
multiple cloning site653–776
pUC origin1174–1841
Amp resistance gene1992-2849

pSC-T结构图