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HKV101-01A pTrx-EK Expression Kit

英文名称:pTrx-EK Expression Kit

货 号 :HKV101-01A

规 格 :1μg/20次

用途:表达载体

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产品名称:pTrx-EK Expression Kit

产品编号与包装规格:

编号产品名称规格产品介绍价格
HKV101-01ApTrx-EK Expression Kit1μg/20次表达载体960

产品描述:
      本质粒以 Nco I 线性化方式提供,请配合环凯Plus PCR 一步定向克隆试剂盒(Cat No:HKNR005)使用。Trx 是实验室中最常用的融合标签之一,能够促进目标蛋白质的溶解性和正确折叠。在需要用肠激酶 Enterokinase(Cat. No:HKPE001)切割的时候,经常会产生非特异性切割,产生两个标签带。pTrx 通过删除部分氨基酸序列,在保留原有 Trx 融合蛋白质优势的同时,避免了非特异性酶切,使酶切结果的判断和目标蛋白质的分离变的更加方便。在不希望使用肠激酶切割时,可通过 Kpn I 位点引入 TEV 或其他蛋白酶切割位点。
      目的基因扩增按常规方法设计引物后,在上游引物 5'端前添加以下序列:GAC GAT GAT GAC AAG;下游引物 5´端引物前添加:TTC GGA TCC GAT ATC。
注意:5´端引物后第一个氨基酸不能为 Pro,如果是 Pro,标签无法切割。不希望目标蛋白 C 端保留 His Tag 时,3´端引物 要加入终止密码子。

产品特点:
      改造后的 Trx 融合标签能够促进目标蛋白质的溶解性和正确折叠。
      特异性切割,便于酶切结果的判断和目标蛋白质的分离。
      环凯 Plus PCR 一步定向克隆试剂盒操作简便,一步完成质粒构建。

应用实例:图示下)用不同量的 EK 酶切割 pET-32a 载体(左图)和 pTrx-EK 载体(右图),结果显 示 pET-32a 载体酶切后标签被非特异性酶切为两个条带。
pTrx-EK Expression Kit应用实例

保存温度:-20℃

pTrx-EK Expression Kit产品包装(A包装):

产品组成体积
pTrx-EK(25ng/μl)40μl
Plus Recombinase20μl
5×Reaction Buffer100μl
Control Insert(50ng/μl)10μl
Enterokinase(10U/μl)50μl

质量保证:pTrx-EK 线性化载体经过严格的自连测试以及连接效率测试,满足下游实验需求。

注意事项:
      1)目的片段的 PCR 产物建议纯化,避免引物二聚体等杂质影响连接反应。
      2)目的片段与载体的摩尔比在 2:1。
      3)引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp序列与线性化载体的两端一致。

使用方法:

A 目的片段的获得
      目的片段通常通过 PCR 获得。引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端序列一致。为保证 PCR扩增 的保真度,请尽可能选用高保真酶,推荐使用 Fast PfuDNA 聚合酶(Cat.No:HKE031)。PCR 每条引物长度至少在 35- 40bp,包括 5'端与载 体同源的 15b 序列以及目的片段特异性 20- 25bp 序列。
(注意:如果是表达载体克隆构建,引物设计完成后,请注意 检 查读码框是否正确。)

B 目的片段与载体的重组

B 目的片段与载体的重组

C 转化(我们建议所使用的感受态细胞效率要大于 5×106 cfu/μg。转化步骤如下:)
      1,冰上融化一支感受态细胞,轻弹管壁使细胞重悬起来。加入 10μl 的反应液到感受态细胞中,用 移液枪吹打混合,冰上放置 30 分钟。
      2,将离心管置于 42℃水浴中,热击 60-90 秒,迅速将离心管置于冰上,放置 2-3 分钟。
      3,向每个离心管中加入 500μl 无菌不含抗生素的LB 或 SOC 培养基中,37℃摇床,150rpm 振荡培养 45 分钟,使质粒上氨苄抗性基因表达,菌体复苏。
      4,吸取 200μl 已转化的感受态细胞,加到含氨苄青霉素的 LB 或 SOC 固体平板上,用无菌涂布棒将细胞均匀涂开,将平板置于 37℃培养箱里直至液体完全吸收,倒置培养 12-16 小时。

D 阳性克隆鉴定
      PCR 检测,利用高速 PCR 扩增试剂 2×Fast Taq Master Mix(Cat.No:HKE029)直接进行菌落 PCR 鉴 定。
      鉴定引物的选择:为避免假阳性结果,我们建议一条引物为载体特异性引物,另一条引物为目的片段特异性引物。

pTrx-EK 结构图:

T7 promoter686 -702
lac O659-683
Trx Tag123 -614
Enterokinase site219-233
T7 Terminator26 -72
F1 origin5356- 5811
Amp resistance4367- 5224
ColE1 Ori3546 -4219
lac I CDS1093 - 2172

pTrx-EK 结构图