产品名称：pTrx-EK Expression Kit
产品编号与包装规格：
| 编号 | 产品名称 | 规格 | 产品介绍 | 价格 |
| HKV101-01A | pTrx-EK Expression Kit | 1μg/20次 | 表达载体 | 960 |
产品描述：
本质粒以 Nco I 线性化方式提供，请配合环凯Plus PCR 一步定向克隆试剂盒（Cat No：HKNR005）使用。Trx 是实验室中最常用的融合标签之一，能够促进目标蛋白质的溶解性和正确折叠。在需要用肠激酶 Enterokinase（Cat. No:HKPE001）切割的时候，经常会产生非特异性切割，产生两个标签带。pTrx 通过删除部分氨基酸序列，在保留原有 Trx 融合蛋白质优势的同时，避免了非特异性酶切，使酶切结果的判断和目标蛋白质的分离变的更加方便。在不希望使用肠激酶切割时，可通过 Kpn I 位点引入 TEV 或其他蛋白酶切割位点。
目的基因扩增按常规方法设计引物后，在上游引物 5'端前添加以下序列：GAC GAT GAT GAC AAG；下游引物 5´端引物前添加：TTC GGA TCC GAT ATC。
注意：5´端引物后第一个氨基酸不能为 Pro，如果是 Pro，标签无法切割。不希望目标蛋白 C 端保留 His Tag 时，3´端引物 要加入终止密码子。
产品特点：
改造后的 Trx 融合标签能够促进目标蛋白质的溶解性和正确折叠。
特异性切割，便于酶切结果的判断和目标蛋白质的分离。
环凯 Plus PCR 一步定向克隆试剂盒操作简便,一步完成质粒构建。
应用实例：图示下）用不同量的 EK 酶切割 pET-32a 载体（左图）和 pTrx-EK 载体（右图），结果显 示 pET-32a 载体酶切后标签被非特异性酶切为两个条带。
保存温度：-20℃
pTrx-EK Expression Kit产品包装（A包装）：
| 产品组成 | 体积 |
| pTrx-EK（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
| Enterokinase（10U/μl） | 50μl |
质量保证：pTrx-EK 线性化载体经过严格的自连测试以及连接效率测试，满足下游实验需求。
注意事项：
1）目的片段的 PCR 产物建议纯化，避免引物二聚体等杂质影响连接反应。
2）目的片段与载体的摩尔比在 2:1。
3）引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp序列与线性化载体的两端一致。
使用方法：
A 目的片段的获得
目的片段通常通过 PCR 获得。引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端序列一致。为保证 PCR扩增 的保真度，请尽可能选用高保真酶，推荐使用 Fast PfuDNA 聚合酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每条引物长度至少在 35- 40bp，包括 5'端与载 体同源的 15b 序列以及目的片段特异性 20- 25bp 序列。
（注意：如果是表达载体克隆构建，引物设计完成后，请注意 检 查读码框是否正确。）
B 目的片段与载体的重组
C 转化（我们建议所使用的感受态细胞效率要大于 5×106 cfu/μg。转化步骤如下：）
1，冰上融化一支感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来。加入 10μl 的反应液到感受态细胞中，用 移液枪吹打混合，冰上放置 30 分钟。
2，将离心管置于 42℃水浴中，热击 60-90 秒，迅速将离心管置于冰上，放置 2-3 分钟。
3，向每个离心管中加入 500μl 无菌不含抗生素的LB 或 SOC 培养基中，37℃摇床，150rpm 振荡培养 45 分钟，使质粒上氨苄抗性基因表达，菌体复苏。
4，吸取 200μl 已转化的感受态细胞，加到含氨苄青霉素的 LB 或 SOC 固体平板上，用无菌涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于 37℃培养箱里直至液体完全吸收，倒置培养 12-16 小时。
D 阳性克隆鉴定
PCR 检测，利用高速 PCR 扩增试剂 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接进行菌落 PCR 鉴 定。
鉴定引物的选择：为避免假阳性结果，我们建议一条引物为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。
pTrx-EK 结构图：
| T7 promoter | 686 -702 |
| lac O | 659-683 |
| Trx Tag | 123 -614 |
| Enterokinase site | 219-233 |
| T7 Terminator | 26 -72 |
| F1 origin | 5356- 5811 |
| Amp resistance | 4367- 5224 |
| ColE1 Ori | 3546 -4219 |
| lac I CDS | 1093 - 2172 |
