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HKV102-01A pTrx-TEV Expression Kit

英文名称:pTrx-TEV Expression Kit

货 号 :HKV102-01A

规 格 :1μg/20次

用途:表达载体

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产品名称:pTrx-TEV Expression Kit

产品编号与包装规格:

编号产品名称规格产品介绍价格
HKV102-01ApTrx-TEV Expression Kit1μg/20次表达载体960

产品描述:
      本质粒以 Nco I 线性化方式提供,请配合 Plus PCR 一步定向 克隆试剂盒(Cat. No:HKNR005)使用。Trx 是实验室中 最常 用的融合标签之一,能够促进目标蛋白质的溶解性和正确折 叠。在需要用 TEV 蛋白酶(Cat. No: HKPE004)切割的时候, 经常会产生非特异性切割,产生两个标签带。pTrx 通过删除部 分氨基酸序列,在保留原有 Trx 融合蛋白质优势的同时,避免了 非特异性酶切,使酶切结果的判断和目标蛋白质的分离变的更加 方便。
      目的基因扩增按常规方法设计引物后,在上游引物 5´端引 物前添加以下序列:CTC TAC TTC CAA GGT;下游引物 5´端引 物前添加:TTC GGA TCC GAT ATC。不希望目标蛋白C 端保留 His Tag 时,3´端引物需要加入终止密码子。

产品特点:
      改造后的 Trx 融合标签能够促进目标蛋白质的溶解性和正确 折叠。
      特异性切割,便于酶切结果的判断和目标蛋白质的分离。
      Plus PCR 一步定向克隆试剂盒操作简便, 一步完 成质粒构 建。

保存温度:-20℃

pTrx-TEV Expression Kit 产品包装(A包装):

产品组成体积
pTrx-TEV(25ng/μl)40μl
Plus Recombinase20μl
5×Reaction Buffer100μl
Control Insert(50ng/μl)10μl
TEV Protease(10U/μl)10μl

质量保证:pTrx-TEV 线性化载体经过严格的自连测 试 以及连接效率测试,满足下游实验需求。

注意事项:
      1)目的片段的 PCR 产物建议纯化,避免引物 二聚体等杂质影响连接反应。 
      2)目的片段与载体的摩尔比在 2:1。
      3)引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端一致。

使用方法:

A 目的片段的获得
      目的片段通常通过 PCR 获得。引物设计要保证目的片段两 端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端序列一致。为保证 PCR 扩增 的保真度,请尽可能选用高保真酶,推荐使用 Fast Pfu DNA 聚合 酶(Cat.No:HKE031)。PCR 每条引物长度至少在 35- 40bp,包括 5'端 与载体同源的 15b 序列以及目的片段特异性 20-25bp 序列。
(注意:如果是表达载体克隆构建,引物设计完成后,请注意 检 查读码框是否正确。)

B 目的片段与载体的重组

B 目的片段与载体的重组

C 转化(我们建议所使用的感受态细胞效率要大于 5×106 cfu/μg。转化步骤如下:)
      1,冰上融化一支感受态细胞,轻弹管壁使细胞重悬 起来。加入 10μl 的反应液到感受态细胞中,用移液 枪吹打混合,冰上放置 30 分钟。 
      2,将离心管置于 42℃水浴中,热击 60-90 秒,迅速 将离心管置于冰上,放置 2-3 分钟。 
      3,向每个离心管中加入 500μl 无菌不含抗生素的 LB 或 SOC 培养基中,37℃摇床,150rpm 振荡培养 45 分钟,使质粒上氨苄抗性基因表达,菌体复苏。
      4,吸取 200μl 已转化的感受态细胞,加到含氨苄青 霉素的 LB 或 SOC 固体平板上,用无菌涂布棒将细 胞均匀涂开,将平板置于 37℃培养箱里直至液体完 全吸收,倒置培养 12-16 小时。

D 阳性克隆鉴定
      PCR 检测,利用高速 PCR 扩增试剂 2×Fast Taq Master Mix(Cat.No:HKE029)直接进行菌落 PCR 鉴 定。
      鉴定引物的选择:为避免假阳性结果,我们建议 一条引物为载体特异性引物,另一条引物为目的 片段 特异性引物。

pNovoTrx-TEV 结构图:

T7 promoter686 -702 
lac O659-683
Trx Tag123 -614
Enterokinase site219-233
T7 Terminator26 -72
F1 origin5356- 5811
Amp resistance4367- 5224
ColE1 Ori3546 -4219
lac I CDS1093 - 2172

pNovoTrx-TEV 结构图