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HKV106-01A pSec Expression Kit

英文名称:pSec Expression Kit

货 号 :HKV106-01A

规 格 :1μg/20次

用途:表达载体

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产品名称:pSec Expression Kit

产品编号与包装规格:

编号产品名称规格产品介绍价格
HKV106-01ApSec Expression Kit1μg/20次表达载体750

产品描述:
      pSec 专为目标蛋白在大肠杆菌中高效分泌表达设计,是预先用 Xho I 线性化的载体,可配合 Plus PCR 产物一步无缝克隆试剂盒 (Cat.No:HKNR005)使用。外源蛋白在大肠杆菌中表达容易形成包涵体,使获得有生物学活性的蛋白增加困难。同时大肠杆菌细胞内为还原环境,目标蛋白二硫键无法形成。周质分泌是获得正确折叠的目标蛋白质的有效途径,常见表达载体往往由于蛋白表达过快,目标蛋白来不及正确折叠和分泌而形成包涵体。该质粒适用于阿拉伯糖诱导,有较强的剂量依赖性。合适的阿拉伯糖浓度能够在保障表达效率的同时获得有效的蛋白质分泌。
      目的基因扩增按常规方法设计引物后,在上游引物 5´端引物前添加以下序列:CCG GCG ATG GCC ATG;下游引物 5´端引物前添加:CGC GGC CGC AAG CTT。
      注意:5´端引物从第一个氨基酸不是甲硫氨酸(ATG)时,可使用 CAG CCG GCG ATG GCC。不希望目标蛋白 C 端保留 His Tag 时,3´端引物需要加入终止密码子。

产品特点:
      pSec 专为目标蛋白在大肠杆菌中高效分泌表达设计。
      Plus PCR 一步定向克隆试剂盒操作简便,一步完成质粒构建。

保存温度:-20℃

pSec Expression Kit 产品包装(A包装):

产品组成体积
pSec(25ng/μl)40μl
Plus Recombinase20μl
5×Reaction Buffer100μl
Control Insert(50ng/μl)10μl

质量保证:pSec 线性化载体经过严格的自连测试以及连接效率测试,满足下游实验需求。

注意事项:
      1)目的片段的 PCR 产物建议纯化,避免引物二聚体等杂质影响连接反应。
      2)目的片段与载体的摩尔比在 2:1。
      3)引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp序列与线性化载体的两端一致。

使用方法:

A 目的片段的获得
      目的片段通常通过 PCR 获得。引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端序列一致。为保证 PCR扩增的保真度,请尽可能选用高保真酶,推荐使用 Fast Pfu DNA 聚合酶(Cat.No:HKE031)。PCR 每条引物长度至少在 35- 40bp,包括 5'端与载体同源的 15b 序列以及目的片段特异性 20- 25bp 序列。
(注意:如果是表达载体克隆构建,引物设计完成后,请注意 检 查读码框是否正确。)

B 目的片段与载体的重组

B 目的片段与载体的重组

C 转化(我们建议所使用的感受态细胞效率要大于5×106 cfu/μg。转化步骤如下:)
      1,冰上融化一支感受态细胞,轻弹管壁使细胞重悬起来。加入 10μl 的反应液到感受态细胞中,用移液 枪吹打混合,冰上放置 30 分钟。
      2,将离心管置于 42℃水浴中,热击 60-90 秒,迅速将离心管置于冰上,放置 2-3 分钟。
      3,向每个离心管中加入 500μl 无菌不含抗生素的LB 或 SOC 培养基中,37℃摇床,150rpm 振荡培养 45 分钟,使质粒上氨苄抗性基因表达,菌体复苏。
      4,吸取 200μl 已转化的感受态细胞,加到含氨苄青霉素的 LB 或 SOC 固体平板上,用无菌涂布棒将细胞均匀涂开,将平板置于 37℃培养箱里直至液体完全吸收,倒置培养 12-16 小时。

D 阳性克隆鉴定
      PCR 检测,利用高速 PCR 扩增试剂 2×Fast Taq Master Mix(Cat.No:HKE029)直接进行菌落 PCR 鉴定。
      鉴定引物的选择:为避免假阳性结果,我们建议一条引物为载体特异性引物,另一条引物为目的片段特异性引物。

pSec 结构图:

pBAD promoter3 - 277
pelB leader319-435
rrnB Terminator456-881
Amp resistance974-1834
pBR322 ori1979-2652
AraC CDS3183-4085

pSec 结构图