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食品微生物检验GB4789.5-2012 志贺氏菌检验及注意事项
发布时间：2020-11-18 浏览次数：17992 分享：
一、志贺氏菌的生物学特性
生物学特性：志贺氏菌属细菌为革兰氏阴性短杆菌，长约2～3μm，宽0.5～0.7μm，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛，不运动；需氧或兼性厌氧，对营养要求不高，在普通培养基（如营养琼脂）上即能生长；最适生长温度35~37℃，适宜pH为6.4~7.8。发酵糖类产酸不产气(福氏和鲍氏志贺菌中的某些血清型偶可产生少量气体)。分为4个群：A群（痢疾志贺氏菌）、B群（福氏志贺氏菌）、C群（鲍氏志贺氏菌）、D群（宋内氏志贺氏菌）。
流行学特征：志贺氏菌产生强烈的内毒素（endotoxin，ET），是一种脂多糖和脂蛋白复合物，为志贺氏菌致病的重要致病因素。A群志贺氏菌Ⅰ型能产生一种毒性极强的细菌外毒素称为志贺毒素（Shigatoxin，Stx），与感染者中毒性腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒症等严重并发症的发生密切相关，其毒性可表现为神经毒性、细胞毒性和肠毒性。在我国以福氏和宋内志贺菌引起的菌痢最为常见。 病人和带菌者是细菌性痢疾的传染源，由于饮食从业人员的带菌，可以使食品污染而造成食物型爆发。由于污水渗入供水系统，也常造成水型的爆发。
二、志贺氏菌的检验
三、培养基原理解析
1. 志贺氏菌增菌肉汤培养基
•培养基中除胰蛋白胨、葡萄糖外，加入新生霉素作抑菌剂，并加入少量的吐温80作增溶剂，以帮助样品的充分分散。
•41℃厌氧培养有助于抑制其它杂菌生长。
2. 麦康凯琼脂培养基（MAC）
•利用胆盐来抑制革兰氏阳性细菌的生长；利用乳糖发酵，中性红的颜色可把分解乳糖和不分解乳糖的细菌区分开。
•志贺氏菌呈无色菌落，半透明，光滑，湿润，圆形，边缘整齐或不齐。
麦康凯琼脂培养（MAC）
3.木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐（XLD）琼脂培养基
•脱氧胆酸钠可以抑制革兰氏阳性细菌和部分大肠杆菌，多数志贺氏菌不能发酵木糖，木糖的添加可将志贺氏菌与其它菌株区别开来，因此，志贺氏菌在XLD平板上呈现无色菌落，但少数发酵木糖的志贺氏菌在此平板上会被漏检，XLD平板对宋内志贺氏菌亦有轻度抑制作用。
•志贺氏菌通常呈粉红色至无色，半透明，光滑，湿润，圆形，边缘整齐或不齐菌落。
木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐（XLD）琼脂菌落特征
4.志贺氏菌显色培养基
•利用非志贺氏菌的特异性的酶，使其与酶底物结合形成不同颜色的菌落，而生化特性反应不活跃的志贺氏菌经22~28h培养后，则形成易于识别的白色-粉红色（与培养基颜色相近）的菌落。
•志贺氏菌呈白色/清晰的菌落，大小约为1～3mm，周围培养基变红。
5.三糖铁琼脂培养基
•该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸使斜面先变黄，但因量少，生产的少量酸。因接触空气而氧化，加之细菌生长利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故斜面后来又变红。底部由于厌氧状态，酸类不被氧化，仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌，则产生大量的酸，使整个培养基呈黄色。另外，因某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应生成黑色的硫化亚铁沉淀。
三糖铁
6.靛基质试验
•某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
•结果判读：阳性为滴加靛基质试剂后液面立即变玫红色； 阴性为滴加试剂后不变红色。
靛基质试验
7.尿素酶试验
•具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素，产生大量的氨，使培养呈碱性，酚红指示剂在pH6.8时呈黄色，pH8.1呈粉红色。
•结果判读：阳性为玫红色； 阴性为淡橙红色-淡黄色。
尿素酶试验
8.赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶试验
•具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺）和二氧化碳，使培养基变碱，使指示剂显示出来。
•结果判读：阳性为试验管为绿色-蓝绿色，对照管变黄色； 阴性为试验管和对照管均变黄色，或均不变色。
赖氨酸脱羧酶试验阳性
9.糖（醇）发酵试验
•绝大多数细菌都能利用糖（醇）类作为碳源和能源，但是它们在分解糖（醇）的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖（醇）并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来断定。
•（指示剂为溴甲酚紫）结果判读：阳性为变黄色； 阴性为紫色。
甘露醇发酵试验
10.β-半乳糖苷酶
•某些细菌可产生b-半乳糖苷酶，能分解邻硝基酚-b半乳糖苷（ONPG），生成黄色的邻硝基酚。
•结果判读：阳性为黄色； 阴性为不变色-淡黄色。
ONPG生化管
11. 葡萄糖铵试验
•鉴别细菌利用铵盐作为唯一氮源并分解葡萄糖的试验。溴麝香草酚蓝是指示剂，产酸时培养基由绿色变黄色。
•结果判读：阳性为黄色； 阴性为绿色。
葡糖糖铵利用试验
12. 西蒙氏柠檬酸盐培养基
•细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，能在除柠檬酸盐外不含其他碳源的培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。
•结果判读：阳性为蓝绿-蓝色； 阴性为绿色。
西蒙氏柠檬酸盐培养基试验
13. 粘液酸盐试验
•某些细菌能利用粘液酸盐，分解产酸，使培养基中的溴麝香草酚蓝变黄色。
•结果判读：阳性为黄色； 阴性为绿色-蓝绿色。
粘液酸盐试验
四、志贺氏菌的生化鉴定
生化反应 | A群：痢疾志贺氏菌 | B群：福氏志贺氏菌 | C群：鲍氏志贺氏菌 | D群：宋内氏志贺氏菌 |
ß-半乳糖苷酶 | －a | － | －a | ＋ |
尿素 | － | － | － | － |
赖氨酸脱羧酶 | － | － | － | － |
鸟氨酸脱羧酶 | － | － | －b | ＋ |
水杨苷 | － | － | － | － |
七叶苷 | － | － | － | － |
靛基质 | －/＋ | (＋) | －/＋ | － |
甘露醇 | － | ＋c | ＋ | ＋ |
棉子糖 | － | ＋ | － | ＋ |
甘油 | (＋) | － | (＋) | d |
注：+表示阳性；-表示阴性；-/+表示多数阴性；+/-表示多数阳性；（+）表示迟缓阳性；d表示有不同生化型。 | ||||
a痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性。 b鲍氏13型为鸟氨酸阳性。 c福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种。 | ||||
•附加生化鉴定
•由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coil.）、A-D（碱性-异型Alkalescens-D isparbiotypes）菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集。需要进一步做葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36℃培养24 h～48 h)。
生化反应 | A群：痢疾志贺氏菌 | B群：福氏志贺氏菌 | C群：鲍氏志贺氏菌 | D群：宋内氏志贺氏菌 | 大肠埃希氏菌 | A-D菌 |
| |||
葡萄糖铵 | － | － | － | － | ＋ | ＋ | ||||
西蒙氏柠檬酸盐 | － | － | － | － | d | d | ||||
粘液酸盐 | － | － | － | d | ＋ | d | ||||
注1：+表示阳性；-表示阴性；d表示有不同生化型。 注2：在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D（碱性-异型）菌至少有一项反应为阳性。 | ||||||||||
|
五、志贺氏菌的血清诊断
•志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原。
•一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原
•在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。
•再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。
•如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，可挑取菌苔于1mL生理盐水做成浓菌液，100℃煮沸15 min～60 min去除K抗原后再检查。
六、所需培养基试剂
用途 | 货号 | 名称 | 规格 |
增菌 | 023141 | 志贺氏菌增菌肉汤 | 瓶（干粉）250g |
SR0380 | 志贺氏菌增菌肉汤配套试剂（新生霉素） | 盒（西林瓶）10支/盒 | |
CP0730 | 志贺氏菌增菌肉汤（需加配套试剂） | 盒（袋装）225 mL×10袋 | |
平板分离 | 029999 | 木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂（XLD） | 瓶（干粉）250g |
029999P1 | 木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂（XLD） | 瓶（颗粒）250g | |
CP0180 | 木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂（XLD） | 盒（平板）90 mm×20 | |
022144 | 麦康凯琼脂 | 瓶（干粉）250g | |
024076 | 麦康凯琼脂培养基平板 | 盒（平板）90 mm×20 | |
CRM011 | 志贺氏菌显色培养基 | 1000mL | |
CRM011A | 志贺氏菌显色琼脂平板 | 盒（平板）90 mm×20 | |
生化鉴定 | 022080 | 三糖铁琼脂（TSI） | 瓶（干粉）250g |
CP0080 | 三糖铁斜面 | 盒（管装）20支 | |
026050 | 半固体琼脂 | 瓶（干粉）250g | |
075350A | 半固体琼脂 | 盒（管装）20支 | |
CP0150 | 营养琼脂 | 盒（管装）20支 | |
024089 | 营养琼脂平板 | 盒（平板）90 mm×20 | |
022020 | 营养琼脂 | 瓶（干粉）250g | |
022020P1 | 营养琼脂(NA) | 瓶（颗粒）250g | |
023090 | 尿素琼脂培养基基础 | 瓶（干粉）100g | |
029100 | 40%无菌尿素溶液 | 盒（西林瓶）10支/盒 | |
生化鉴定 | 075150 | 尿素（冻干） | 盒（西林瓶）10支/盒 |
075280 | 赖氨酸脱羧酶培养基 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075270 | L-鸟氨酸脱羧酶培养基 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075290 | 氨基酸脱羧酶对照培养基 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
029110 | 无菌石蜡油 | 10 mL×1支 | |
075180 | β-半乳糖苷ONPG | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075140 | 水杨素（水杨苷） | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075160 | 七叶灵（七叶苷） | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075040 | 甘露醇 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075230 | D-棉籽糖 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
生化鉴定 | 022110 | 蛋白胨水(靛基质培养基，色氨酸肉汤) | 瓶（干粉）100g |
075240 | 蛋白胨水(靛基质培养基，色氨酸肉汤) | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
029230 | 靛基质试剂 | 10 mL×1支 | |
075840 | 甘油发酵管 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075260 | 葡萄糖铵 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
023150 | 葡萄糖铵培养基 | 瓶（干粉）250g | |
075200 | 西蒙氏柠檬酸盐 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
022120 | 西蒙氏柠檬酸盐培养基 | 瓶（干粉）250g | |
075521 | 粘液酸盐测试肉汤 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075522 | 粘液酸盐质控肉汤 | 盒（西林瓶）20支/盒 |
