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HKT003系列 Easy Cloning T-vector (pEC-T)

英文名称:Easy Cloning T-vector (pEC-T)

货 号 :HKT003系列

规 格 :20次 | 20次×5

用途:由pBluescript II KS 载体改造而成

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产品名称:Easy Cloning T-vector (pEC-T)

产品编号与包装规格:

编号产品名称规格产品介绍价格
HKT003-01AEasy Cloning T-vector (pEC-T)20次T载体540
HKT003-01B20次×52398

产品描述:
      Easy Cloning T-vector是一种PCR 产物高效TA克隆的专用 T载体。它由pBluescript II KS 载体改造而成:保留了pBluescript II KS 载体全部的酶切位点;PCR 产物插入位点处于多克隆酶 切位点的中间,其两侧都有众多的酶切位点可供选择。
      由于本载体以 pBluescript II KS 载体为基础构建而成,所以 它具有同pBluescript II KS 载体相同的功能:PCR 产物插入后可 以利用α-互补性进行蓝白斑筛选,挑选阳性克隆。可以用 M13 通用引物和T7,T3 启动子引物对PCR 产物进行测序。含有 T7 及T3RNA 聚合酶的启动子,可以对插入片段进行体外转录。

产品特点:提供 2×快速连接系统(15 分钟即可完成连接反应)及 10× 传统型连接系统(过 夜连接可获得最佳连接效果),具体使用说 明见后。

使用建议:
      1)连接使用的PCR片段3' 端应带有A末端,如果是使用Pfu等 高保真聚合酶扩增的不带A末端的平末端片段,不可直接用于 进行连接反应。
      2)克隆时使用的Insert DNA片段(PCR产物)建议进行切胶 回收纯化,否则PCR产物中的短片段DNA、残留引物等杂质都 会影响TA克隆效率。
      3)转化过程中建议使用 Control Insert DNA 做对照,以便在实 验出现问题时确定原因。

保存温度:-20℃

Easy Cloning T-vector (pEC-T) 产品包装(A包装):

Easy Cloning T-vector (pEC-T) 产品包装(A包装)

质量保证:
   Control Insert 克隆后的白色菌落中,有 90%以上含 有Insert DNA 片段。
   Control Insert 克隆后,经测序确认''T''突出的存在。

操作方法:
      1) 选择合适的连接体系(详细介绍见背面)。 
      2) 取10 μL 加入至 100 μL 感受态细胞中,用移 液枪吹打混合,冰上放置30 分钟。 
      3) 将离心管置于 42℃水浴中,热激 60-90 秒,迅 速将离心管置于冰上,放置 2-3 分钟。 
      4) 向每个离心管中加入 500μL 无菌不含抗生素的 LB 或SOC 培养基中,37℃摇床,150rpm 振荡培养 45 分钟,使质粒上氨苄抗性基因表达,菌体复苏。
      5) 吸取200μL 已转化的感受态细胞,加到含氨苄 青霉素的 LB 或SOC 固体平板上,用无菌涂布棒将细 胞均匀涂开,将平板置于 37℃培养箱里直至液体完全 吸收,倒置培养 12-16 小时。  
      6) PCR检测,利用试剂盒自带的高速PCR扩增试 剂2×FastTaq Mast Mix直接进行菌落PCR鉴定。

A、常规连接反应体系(20μL)

组分体积
10×Ligation Buffer2μL
pEC-T vector(25 ng/μL)2μL
目的PCR 片段/ Control Insert DNAX μL/1 μL
T4 DNA Ligase1μL
ddH2O至 20μL

反应条件:
1)16℃保温 3 小时以上或过夜。 2)在4℃保温过夜,或室温数小时,但反应效率较16℃过夜略低。 实践表明连接反应的温度越低,达到理想连接效率所需时间越长,温度 较高则所需时间较短。

注:10×Ligation Buffer融化时,如果出现少量沉淀属正常现象,请 于37℃溶解混匀后使用。

B、 快速连接反应体系:

组分体积
2×Quick Ligation Buffer10μL
pEC-T vector(25 ng/μL)2μL
目的PCR 片段/ Control Insert DNAX μL/1 μL
T4 DNA Ligase1μL
ddH2O至 20μL

反应条件:
1)16℃ 或 25℃下,保温15至30分钟。 

2)保温5分钟也能正常进行反应,但反应效率略为降低。 25℃下进行连接,其效果略差于16℃下连接效果。而更高 的温度(>26℃)则较难形成环状DNA。连接效率偏低时, 可适当延长连接反应时间,但过长的连接时间(如数小时) 连接效果反而会变差。一些较难连接的片段(如大片段), 请采用传统型10×T4 DNA Ligation Buffer体系进行尝试。

pEC-T结构图