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HKV104-01A pAvi-C Expression Kit

英文名称:pAvi-C Expression Kit

货 号 :HKV104-01A

规 格 :1μg/20次

用途:表达载体

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产品名称:pAvi-C Expression Kit

产品编号与包装规格:

编号产品名称规格产品介绍价格
HKV104-01ApAvi-C Expression Kit1μg/20次表达载体750

产品描述:
      pAvi-C 专为目标蛋白 C 端融合 Avi Tag 设计,是预先用 Nde I 线 性 化 的 载 体 , 可 配 合 Plus PCR 一 步 定 向 克 隆 试 剂 盒 (Cat.No:HKNR005)使用,用于在大肠杆菌中快速高效表达和 蛋白质 Biotin 标记。为保证标记效率,请选择高表达 Biotin 化酶的 宿主菌 Biotin Competent Cell(Cat.No:HKV207)。
      目的基因扩增按常规方法设计引物后,在 5´端引物前添加以 下序列:GAA GGA GAT ATA CAT;3´端引物前添加:GAT GTC GTT CAG GCC 。
      注意:5´端引物从第一个氨基酸开始(ATG),3´端引物不要 包含终止密码子。

产品特点:
      pAvi-C 用于在大肠杆菌中快速高效表达和蛋白质 Biotin 标记。
      PCR 一步定向克隆试剂盒操作简便,完成质粒构建。

保存温度:-20℃

pGST-TEV Expression Kit 产品包装(A包装):

产品组成体积
pAvi-C(25ng/μl)40μl
Plus Recombinase20μl
5×Reaction Buffer100μl
Control Insert(50ng/μl)10μl

质量保证:pAvi-C 线性化载体经过严格的自连测试 以 及连接效率测试,满足下游实验需求。

注意事项:
      1)目的片段的 PCR 产物建议纯化,避免引物 二聚体等杂质影响连接反应。
      2)目的片段与载体的摩尔比在 2:1。 
      3)引物设计要保证目的片段两端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端一致。

使用方法:

A 目的片段的获得
      目的片段通常通过 PCR 获得。引物设计要保证目的片段两 端有至少 15bp 序列与线性化载体的两端序列一致。为保证 PCR 扩增 的保真度,请尽可能选用高保真酶,推荐使用 Fast Pfu DNA 聚合 酶(Cat.No:HKE031)。PCR 每条引物长度至少在 35- 40bp,包括 5'端 与载体同源的 15b 序列以及目的片段特异性 20-25bp 序列。
(注意:如果是表达载体克隆构建,引物设计完成后,请注意 检 查读码框是否正确。)

B 目的片段与载体的重组

目的片段与载体的重组

C 转化(我们建议所使用的感受态细胞效率要大于 5×106 cfu/μg。转化步骤如下:)
      1,冰上融化一支感受态细胞,轻弹管壁使细胞重悬 起来。加入 10μl 的反应液到感受态细胞中,用移 液 枪吹打混合,冰上放置 30 分钟。 
      2,将离心管置于 42℃水浴中,热击 60-90 秒,迅 速将离心管置于冰上,放置 2-3 分钟。
      3,向每个离心管中加入 500μl 无菌不含抗生素的 LB 或 SOC 培养基中,37℃摇床,150rpm 振荡培 养 45 分钟,使质粒上氨苄抗性基因表达,菌体复 苏。
      4,吸取 200μl 已转化的感受态细胞,加到含氨苄青霉素的 LB 或 SOC 固体平板上,用无菌涂布棒将细 胞均匀涂开,将平板置于 37℃培养箱里直至液体完 全吸收,倒置培养 12-16 小时。

D 阳性克隆鉴定
      PCR 检测,利用高速 PCR 扩增试剂 2×Fast Taq Master Mix(Cat.No:HKE029)直接进行菌落 PCR 鉴定。
      鉴定引物的选择:为避免假阳性结果,我们 建议一条引物为载体特异性引物,另一条引物为目 的 片段特异性引物。

PAvi-C 结构图:

T7 promoter27-43
lac O46-70
Avi Tag118-162
T7 Terminator257-303
F1 origin340-795
Kan resistance891-1703
pBR322 ori1799-2472
lacI CDS3846-492

PAvi-C 结构图