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sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit(sgRNA体外一步转录试剂盒)

英文名称:sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit

货 号 :HKE369

规 格 :10次

用途:sgRNA体外一步转录

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产品名称:sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit
中文名称:sgRNA体外一步转录试剂盒

产品编号与包装规格:

编号产品名称规格产品介绍价格
HKE369sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit10次crispr基因编辑(一步法sgRNA 体外转录试剂盒)1275

产品描述:
      CRISPR/Cas9 是 一 种 来 源 于 细 菌 获 得 性 免 疫 的 由 RNA 指 导 Cas9 蛋 白 对 靶 向 基 因 进 行 编 辑 的 技 术 。 CRISPR/Cas9 的切割是通过向导 RNA(gRNA)与打靶基因组位置之间约 20bp 碱基的配对,且打靶序列的 3′端需要有 PAM 结构(NGG),再引导 Cas9 作用实现的。CRISPR/Cas9 与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM 处 10~12 bp碱基的配对,而其余远离PAM 处8~10 bp 碱基的错配对靶位点的识别影响不明显,这导致了CRISPR/Cas9 存在一定的脱靶性,可能发生非特异性切割,引起基因组非靶向位点的突变,这样会造成研究结果的不确定性以及 研究工作量的大量增加。环凯生物CRISPR/Cas9 基因编辑系统能有效解决这一问题。
      sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit(一步法sgRNA 体外转录试剂盒)能够一步法体外高效转录不同的 sgRNA 片段,进一步通过 sgRNA 体外筛选及基因型鉴定试剂盒(Cat.No:HKE370)筛选出脱靶率低的 sgRNA,用 于后续科研实验。

产品特点:
      一步法高效转录不同的 sgRNA 片段,操作简单快捷;
      sgRNA 产量可达 10-30μg。

保存条件:-20℃保存,或-80℃长期保存。

sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit 产品组成:

产品组成体积
2×sgRNA Reaction Buffer150 μL
Enzyme Mix20 μL
DNase I(2U/μL)10 μL
RNase Free Water1 mL

流程模式:

sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit 流程模式

操作步骤:

I,sgRNA 模板扩增
      扩增引物设计(选取Target DNA序列PAM(NGG)的5'端20 bp 进行正向(F)引物设计,引物结构包含T7 promoter(20 bp)、Target DNA 片 段(20 bp)和实际与反向引物结合的片段(21 bp)。引物设计如下:)

sgRNA 模板扩增

II,sgRNA 体外转录体系
      依次加入以下反应组分配制转录体系:

2×sgRNA Reaction Buffer10 μL
正向引物(10 μM)2 μL
Enzyme Mix2 μL
RNase Free WaterTo 20 μl

37 ℃保温 1 h、70℃保温 10 min 
注: 转录时间0.5-2 h 即可,如需得到更多 sgRNA,可适当延长至 3 h。

III,sgRNA 纯化

模板 DNA 的去除:向转录产物中加 1μL DNase Ⅰ,37°C 反应10 min,以去除 DNA 模板,将反应产物放入 75℃反应 10 min, 得到 的 sgRNA 置于-20℃保存。sgRNA 可直接用于切割,如需纯化,可选择以下 sgRNA 纯化步骤,但 sgRNA 会有所 损失。

sgRNA 纯化(可选):
      1. 转录体系 20 μL 用 RNase Free Water补至 300 μL,加入等体积酚•氯仿•异戊醇(25:24:1),充分混合后, 12000 rpm,4°C 离心 15 min。 
      2. 取上清,加入 300μ L 氯仿,充分混匀后,12000r pm,4℃离心 5 min。
      3. 取上清约 200 μL,为提高回收量,下层可再加入 100 μL RNase Free Water,充分混合后,4℃离心 5 min, 取上清。
      4. 将两次取的上清合并,总体积约 300~350 μL,加入 2 倍体积的异丙醇和 1/10 体积的用 RNase Free Water 配置的 3M NaAc,-80°C 沉淀过夜。
      5. 离心取沉淀,加入 1 mL RNase Free Water配制的 75%乙醇,洗涤两次。
      6. 用 20 μL RNase Free Water溶解 RNA,电泳检测质量并进行浓度测定。

应用实例:

图例一:使用一步法sgRNA 体外转录 试剂盒转录sgRNA,大小为97 nt。
      泳道1:DL2000; 
      泳道 2、3、4:sgRNA

使用一步法sgRNA 体外转录 试剂盒转录sgRNA,大小为97 nt

图例二:将转录出的sgRNA 做体外 切割检测。
      泳道 1:DL2000; 
      泳道 2 、3 : sgRNA 切割后条带 1500bp、1000bp、500bp

将转录出的sgRNA 做体外 切割检测