常见的细胞培养问题
发布时间：2022-06-13 浏览次数：1699
1. 解冻后观察:
| 1-1 镜检(Microscopic) | 可能引起的原因 | 解决方式 |
1-1-1 细 胞 数 少 | 1. 解冻后若以离心方式去除DMSO，部分细胞未有效沉淀，细胞数将会减少。
2. 有些细胞容易絮聚而沈积在冷冻管底部，若吸取细胞悬浮液前没有充分混合均匀，则可能只吸到细胞数较少的上清液。 | 1. 考虑直接将解冻后的细胞悬浮液加入含新鲜培养基中直接培养，细胞贴附后，第二天再更换培养基。 2. 细胞解冻后 pipetting 5 至 7次，混合均匀。 |
1-1-2 存 活 率 不 佳 | 1-1-2-1 有些细胞本身冷冻后存活率不佳或细胞数较少。 | 解冻后先培养在 T25 flask。 |
1-1-2-2 解冻后受 DMSO 毒害: 1. 细胞对 DMSO 的毒性较为敏感，例如:HL-60 细胞。 2. 细胞解冻后，细胞悬浮液在冷冻管内时间拖太久。
3. 解冻后的细胞悬浮液种至(seeding) 含新鲜培养基的flask 内，但由于培养基量太少而不足以稀释 DMSO 的毒性。 | 1. 解冻后的细胞必须立刻经由离心方式去除 DMSO。 2. 先将所有实验材料准备齐全，培养基预热好再进行解冻。 3. 至少加入 10ml 以上的新鲜培养基或使 DMSO 浓度在 1 %以下。 | |
1-1-2-3 解冻前后受温度变化之伤害: 1. 收到本所寄出的细胞后没有马上解冻培养或是暂存在-80℃冰箱的时间太久。
2. 从液氮筒将冷冻管取出至解冻这段期间没有以干冰或液氮携带。 3. 以瞬间加温使冷冻管内的冰块外围融解，并将细胞冰块取出加至新鲜培养基的方式解冻。（未待冷冻细胞完全溶解即操作）。 4. 有些细胞须培养于 28℃，培养基亦必须预热至 28℃，但若以 37℃操作则会使细胞冻后存活不佳。 | 1. 收到细胞后最好是尽速解冻培养或暂存于-80℃冰箱，并于翌日转移到液氮筒内。若暂存于 -80℃冰箱时，时间不宜太久，以 1-2 天为宜。 2. 以干冰或液氮暂存筒移送。
3. 将冷冻细胞迅速完全解冻后，经酒精擦拭冷冻管后，立刻移入无菌操作台操作。
4. 以 28℃快速解冻。培养基亦预热于 28℃水浴槽，而非 37℃，如一般鱼类细胞、昆虫细胞、蚊子细胞等。 | |
1-1-2-4 渗透压伤害(Osmotic damage) 1. 冷冻后的细胞悬浮液直接快速加入培养基中。
2. 解冻后的细胞悬浮液加入PBS 以稀释 DMSO 的毒性。 | 1. 将培养基以一滴一滴加入的方式加至细胞悬浮液中。若是直接 seeding 至 flask 中，除了上述的做法外，可将已装有培养基的 flask 倾斜，然后加入细胞悬浮液使其沿着瓶壁慢慢滑入培养基中。 2. 改用培养基稀释。 | |
1-1-2-5 没有依照本所所建议使用的培养基。 | 冷冻细胞的活化，请绝对依照建议使用的培养基。待细胞生长良好且已保存一批冷冻备份细胞后，再进行其他培养基之置换工作。 |
2. 解冻后数日及继代培养后观察: (参考文献 1 和 2)
| 2-1 巨观(Macroscopic) 依培养基颜色判断 | 可能引起的原因 | 解决方式 |
| 2-1-1 呈黄色混浊 | 污染。很可能是细菌或酵母菌污染。 | 丢弃已污染的细胞。 |
2-1-2 黄 色 澄 清 | 1. 细胞已长满或过度长满。 2. 培养基太酸，但并不是因为细胞代谢所导致的，而是因为培养箱中过高浓度CO2 造成。 3. 霉浆菌污染。 | 1. 立刻继代培养。 2. 根据细胞的需求给予适当浓度的 CO2，并检查培养箱之 CO2 浓度是否正确。
3. 进行霉浆菌检测，若为positive，丢弃之。 |
2-1-3 明 亮 紫 红 色 | 培养基太硷 1. 最有可能是培养箱中过低浓度的 CO2 所造成。 2. 瓶盖锁太紧或未松开。
| 1. 检查 CO2 供应是否正常。
2. 将盖子稍微旋松。 |
2-1-4 类 似 绵 花 状 的 漂 浮 物 | 可能是真菌污染。这类的污染在早期并不会使得培养基变黄。但在显微镜下可观察到菌丝体。 | 丢弃已污染的细胞。另外，必须检视培养箱内有无这类真菌的污染，因为污染的细胞培养基溢出时可能会促进该类真菌的生长。 |
2-2 镜检(Microscopic) | 可能引起的原因 | 解決方式 |
2-2-1 细 胞 生 长 状 态 不 佳 (附注 a) | 1. 霉浆菌污染。
2. 细菌所引起的慢性、较低程度的感染。 3. 培养基成分改变。有些细胞对此种改变特别敏感，例如更换新的血清; 使用过期的 glutamine 及其它添加成分、较差的水质、或是少加了某些添加物 ( 例 如nonessential amino acid)。 4. 贴附性细胞继代培养时过度地 trypsinized，或是稀释比例(split ratio)过高。
| 1. 做污染检测，若有霉浆菌污染则丢弃。 2. 污染检测。
3. 培养基及其它添加物使用前必须更特别注意。
4. Tryspin 作用时应以倒立显微镜观察细胞脱落的情形，并适时终止 trypsin 作用。使用 trypsin时应注意其保存期限及使用的次数，避免 trypsin 失活。 |
2-2-2 一串串珠状物 | 酵母菌生长而成之成串的珠状物。大约比细胞小 5~10 倍。 | 直接丢弃。 |
2-2-3 生 长 太 慢 | 通常是霉浆菌所引起，但仍有许多其它的可能性会导致生长过慢： 1. 培养基过期或是没有适当的贮存。 2. Glutamine 贮存时间太长。 3. 血清-更换使用其它批号或品牌的血清或是血清种类使用错误，又或者是浓度配制错误。 4. 培养箱的温度或是二氧化碳的浓度不对。 5. 培养器材和培养基成分应选用细胞培养用的等级。 6. 处理细胞之程序不佳，例如 trypsin 作用时间过长；细胞长太满才继代培养；或是继代培养的稀释比例太高。 | |
2-2-5 特 性 改 变 | 1. 培养基不正确(但细胞仍可生长)。 2. 长期继代，自然筛选结果。 3. 培养基不正确(但细胞仍可生长)。 4. 长期继代，自然筛选结果。 | 建议停止继续使用，除非对此种特性改变，有研究之价值，另当别论。 |
附注 a:细胞生长状态不佳可能产生的现象:
悬浮细胞会以半贴附、暗沈、生长不良、粗糙不平整、细胞周围含有囊泡并含有大量的细胞碎片。贴附性细胞除了上述特征外，细胞容易脱离底部。
参考文献:
1. Darling, D.C. and Morgan, S.J. (1994) Animal cells culture and media.Wiley. John Wiley& Sons. Inc., publication.
2. Freshney, R.I.(2000) Culture of animal cells.4th ed. Wiley-Liss. John Wiley& Sons. Inc., publication.
