Milonese新作丨《GB 4789.2-2022 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》文本变化情况初探
发布时间：2022-10-12 浏览次数：6694
GB 4789.2-2022标准变更初探
菌落总数测定是食品微生物检验中应用得最为广泛一个检测方法，其国标方法文本屡经修订，不断完善。历经了1984版、1994版、2003版、2008版、2010版、2016版到今天的2022版，在38年间已经陆续修订发布了7个版本，平均5年修订一次，这应该是GB4789系列里之最了，恐怕在国家标准中也不多见，足见其重要性。
即将实施——：
《GB 4789.2-2022 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》于2022年6月30日发布，将于2022年12月30日起正式实施。在这半年的新旧版过渡期内，广大食品检测机构应组织技术人员深入学习和理解新旧标准文本的差异，并进行必要技术性验证。以下就是笔者对新版标准文本变更的一些粗浅认识，希望达到抛砖引玉的效果。
作为一个应用广泛、检测频次较高的方法标准，其细微的变化都会引起业界的关注，尤其是某些重大的变化甚至还可能会带来一系列的连锁效应。总的来说，新版标准再次引入了测试纸片法，这应该是一个突破，预示着今后国标方法体系对于传统方法的可能会有更多的补充，此外还增加了菌落计数范例，完善了一些文字方面的细节，进一步增强了方法标准的可操作性、实用性、灵活性。
设备材料
将3.3中原来的“恒温水浴箱”修改为“恒温装置”，扩大了适用范围，便于实验室灵活采用各种适宜的保温方式，并将温度范围由“46℃±1℃”改为“48℃±2℃”，以呼应后文中设备和温度范围的变化。在实际应用中，很多实验室在恒温水浴箱之外可能还采用了专用的培养基液化保温装置等设备，新标准修订之后赋予了这些补充手段的合规性。无论采用怎样的等效手段，实验室一定要重视保温装置的温度校准和日常监控、维护保养。
培养基和试剂
（一）增加了“4.2菌落总数测试纸片：应符合GB4789.28中平板计数培养基质量控制要求，且主要营养成分与平板计数琼脂培养基配方一致”。
1、相较于传统的平板倾注法，测试纸片法具有易用、便捷、高效、不具热损害的优点，测试纸片法首次出现在2008版并作为第二法，但仅在两年后即在2010版中被删除。而类似的《SN/T 1897-2007 食品中菌落总数的测定 Petrifilm™测试片法》比2008版更早发布实施，但也已于2015年被废止，给出的理由是“方法涉及试剂盒，未经评估”。[1]目前涉及纸片法的现行有效的行业标准《SN/T 4544.1-2016 商品化试剂盒检测方法 菌落总数 方法一》以及即将实施的《SN/T 4544.2-2022 商品化试剂盒检测方法 菌落总数 方法二》，明确了测试纸片的商品化试剂盒性质。然而，这次修订的文本并未将测试纸片法作为第二法来呈现，可能也还是出于审慎的态度。
2、测试纸片“主要营养成分与平板计数琼脂培养基配方一致”即指符合附录A.1的PCA主要成分，包括：胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖，至于其他成分如显色剂、冷凝胶等各品牌配方可能会有差异。实验室应要求厂家提供配方证明文件，并作比较确认。
3、至于测试片的技术性验收，如果参照现行的GB 4789.28可能不具可操作性，因为需要进行划线测定生长率，鉴于测试纸片的物理性状可能不太适合，只能等待新版的GB 4789.28正式发布。目前可供参考的是《SN/T 4544.1-2016 商品化试剂盒检测方法 菌落总数 方法一》和《SN/T 4544.2-2022 商品化试剂盒检测方法 菌落总数 方法二》附录中的评价方法。该附录参照《SN/T 2775-2011 商品化食品检测试剂盒评价方法》要求，评价了特定品牌测试纸片与国标法的线性关系及准确度、耐变性、批间差异，并进行了实验室间验证试验。程序比较复杂，工作量较大，对于一般的实验室可能较难完成。
（二）将老版的“生理盐水”和“磷酸盐缓冲液”均加上了“无菌”作为定语修饰，与后文6.1中的描述呼应，也进一步强调了无菌操作。
（三）测试纸片的相关知识[2]
1、检测原理：测试片主要由培养基、冷水可凝胶、显色剂组成，菌落总数大多数用的显色剂是TTC。细菌在测试片上生长时，细胞代谢产物与浓度极低的指示剂TTC发生氧化还原反应，将指示剂还原成红色产物，从而使细菌着色。所以，大多数测试片上红色菌落判断为菌落总数。
2、适用范围：由于操作简单，被广泛使用于加工过程菌落总数快速测定。适用于大部分食品及环境涂抹样本，适用范围较广泛。
3、常见品牌：目前市场上的主流测试片形式有测试片和测试板，测试片又分冷水可溶性凝胶的和无纺布两种，测试板多为板上加无纺布的形式。常见的进口品牌包括美国3M、美国Charm、日本DNP、德国默克等，国产品牌有陆桥、环凯、美正等。
4、常见的问题
① 出现菌落蔓延、水化现象。冰淇淋、糕点、加工肉制品、调味料等食品中的芽孢杆菌易发生液化现象，可以通过减少堆叠数量或者进一步稀释来解决。
② TTC作为指示剂是否会抑制菌落的生长？测试片添加的极低浓度TTC不足以对多数常见微生物造成抑制，此外多数测试片的工艺采取的是分层涂布，TTC位于最上层，因此只有当菌落凸出之后才能接触到低浓度TTC。
③ 颜色较深的样品可能会有干扰，部分辛辣调味料会有干扰抑制，可选择合适的稀释倍数或带滤网的均质袋进行样品处理，具体依据各厂家的技术声明来执行。
④ 开封后测试片保存方式。密封夹密封后，常温/冷藏、避光、干燥保存，并于1个月内使用完。如果从冰箱中取出后要常温放置一段时间再打开使用以防止冷凝水的产生。
检验程序
主要是对“图1 菌落总数的检验程序”增加了一些注释性文字：
1、将“2个~3个适宜稀释度”改为“1个~3个适宜稀释度”，与后文“6.1.5”的改动保持一致。
2、“培养”框之下的箭头旁增加“36℃±1℃，48h±2h”和“水产品30℃±1℃，72h±3h”的文字描述。
操作步骤
（一）样品的稀释
1、6.1.1和6.1.2中提及的“生理盐水”和“磷酸盐缓冲液”均增加了“无菌”作为修饰定语。
2、6.1.2 中增加了“或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min”明确了液体样品允许使用均质器进行均质，这是符合现实需要的改变。此外，还增加了“如果结果单位为g的时候按6.11取样方式前处理”的描述，解决了冰块、冰淇淋等固体样本融化后取样方式的困扰。
3、6.1.3 中将“振摇试管或用1支无菌移液管反复吹打使其混合均匀”改为“在振荡器上振荡混匀”。
4、6.1.5中将“2~3个适宜稀释度”改为“1~3个适宜稀释度”，更加灵活，切合实际情况。允许只做1个梯度，减少了检测的工作量，但对检验经验和操作水平要求更高了，如果仅有的一个梯度出现多不可计或平行不好的情况则难以保证检测结果的可靠性，此外如果出现样本中抑菌物质造成的计数结果与稀释度不成比例现象，也不容易发现，因此建议尽量采用2~3个稀释度以规避可能的风险。
5、从此处开始，文中所有的“平皿”均替换为“培养皿”，更加规范和准确，但其他同时期发布的新标准中并未执行这一术语的统一。
6、6.1.6中的平板计数琼脂温度由“46℃”改为“46℃~50℃”，相应地，括弧内恒温水浴锅及其温度均改为“恒温装置”和“48℃±2℃”。美国FDA BAM规定为45℃±1℃，ISO 4833-1：2013为44℃~47℃（将改为47℃~50℃）。在实际工作中，尤其是冬季气温较低的时候，考虑到倾注的时间，适当提高琼脂的温度使得更具可操作性。然而过高的温度可能会对某些细菌造成损伤，影响结果，因此实验室务必把握好尺度。
（二）培养
1、6.2.1这里的仍然沿用的“平板”而非之前的“培养皿”，是笔误还是修订者认为倾注了培养基的培养皿才能叫做平板呢？并且在段首的“待琼脂凝固后”之前加了“水平放置”作为状语进行修饰，强调了操作细节。
2、原来的6.2.2合并到了6.2.1的段末。
3、原6.2.2改为：“如果使用菌落总数测试片，应按照测试片所提供的相关技术规程操作”。这里所谓的技术规程，应该就是指的其使用说明书，市场上的测试纸片品牌较多，种类也较多，具体操作细节可能存在一定的差异性，实验室应仔细阅读说明书，建立作业指导书，对操作人员进行培训和考核。
4、水产品的培养温度和时间仍然保持不变，但在工作实践中，检验员往往会对“水产品”指代的范围产生困惑，新版标准能够给与一个明确的定义和举例就更好了。
（三）菌落计数
6.3.2中删掉了段末的“每个稀释度的菌落总数应采用两个平板的平均数”，应该是避免与后面7.1.2中的公式应用产生歧义。
结果与报告
（一）菌落总数的计算方法：详细规定了6种情形的菌落计算方法，并且还在附录B中逐一提供了相应的案例，便于读者理解。
（二）菌落总数的报告：删掉了老版的“7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延”，这是因为前文6.3.2已经明确要选择“无蔓延菌落生长”的平板，故实际上已经明确蔓延菌落为不适合计数的情况，所以这句话是多余的。
主要参考文献
[1]国家认监委办公室关于公布2015年检验检疫行业标准复审结论的通知
[2]微信公众号：六扇门study——GB4789.2修订一大亮点：增加测试片方法的并行准入
文章来源：网友Milonese原创分享，环凯小编转载于食品微生物检测公众号！
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