细胞传代方法和注意事项
发布时间：2023-03-28 浏览次数：3956
传代培养几乎是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长到一定密度都会因为接触抑制而停止生长，之后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需，但培养皿中的细胞很容易受到外界污染，所有操作要在严格的无菌条件下进行。
今天为大家分享细胞传代（以HEK-293T细胞传代为例）的方法和注意事项。
实验器材
材料：培养瓶/皿，离心管，移液管，移液器，废液缸，75%酒精，所需培养细胞。
药品：DMEM培养基，小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS缓冲液，青链霉素双抗。
仪器：CO₂培养箱，显微镜，超净台。
实验步骤
以HEK-293T细胞传代为例
1. 从培养箱拿出细胞，镜下观察细胞状态，并判断是否达到了可传代的密度；
2. 回到超净台中，吸去培养基，加入2ml左右PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞，吸去PBS，加入0.25%胰酶，轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞；
3. 放入37℃培养箱，开始消化并计时，消化时间跟据细胞特性有所不同，例如HEK-293T细胞消化时间为2min；
4. 用含10%血清的DMEM培养基终止，通过反复吹打使细胞脱离培养皿底部，尽量呈单颗细胞的悬浮液（可以在显微镜下观察）；
5. 收集细胞悬液离心，室温下1200rpm，5min（不同细胞离心参数设置不同），离心完吸出上清丢弃（此时可以看到细胞在管底形成肉眼可见的细胞团块，团块大小与细胞多少有关，拿取过程中小心不要发生碰撞）；
6. 在新的培养皿种加入新鲜培养基，用新鲜培养基将细胞重悬，吹打几下混匀细胞，将细胞接种到新培养皿，摇晃混匀；
7. 将培养皿放入培养箱。
注意事项
1. 无菌操作规范：在实验开始前和结束后，需要将超净台紫外照射灭菌30min，要穿好灭菌服，戴好灭菌手套和口罩。
2. 所有物品从外面移入超净台都需要喷洒75%酒精消毒，并且同样用75%酒精消毒双手。
3. 使用胰酶消化细胞要把握好时间，切勿消化过度，及时终止消化。如果消化不够充分可以轻拍培养皿帮助细胞脱落。
4. 弃上清的动作需一次完成，切忌抬起管口，让液体流回底部后，又再次倾倒。回流的液体会把细胞团块冲散甚至冲起来，再倾倒有把细胞团块倒掉的风险。
5. 养成在培养皿上做标记的习惯，注明传代时间，细胞种类。
来源：“Bioqure”公众号
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