DNA提取基本知识（裂解与纯化详细介绍！）
发布时间：2023-08-23 浏览次数：3836
DNA提取分为裂解和纯化两大步骤，裂解的目的是破坏样品细胞结构，使细胞中的DNA游离在裂解体系中，纯化的目的是使DNA与裂解体系中的其它组分（蛋白质、盐、多酚等）分离。
裂 解
常规的裂解液都含有去污剂(如SDS、CTAB、Triton X-100、NP-40、Tween 20等)和盐(如Tris、EDTA、NaCl等)。去污剂能使蛋白质变性、破坏膜结构，同时去除与核酸相互结合的蛋白质。盐能够提供合适的裂解环境、抑制核酸酶的降解作用，维持核酸结构稳定。
裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进DNA与蛋白质的分离，同时也便于后续的纯化操作。
纯 化
沉淀法
利用酚/氯仿抽提去除蛋白质，再用乙醇或异丙醇沉淀DNA。
* 酚氯仿抽提是去除蛋白质的有效手段，但如果蛋白质含量超过了其饱和度，裂解体系中的蛋白质就不会被一次性去除，需要进行多次反复抽提，而每次的抽提均会导致核酸的损失。
图1 沉淀法DNA提取过程示意图
离心柱法
通过离心柱上的吸附膜，特异性吸附DNA。
* 离心柱法受人为操作因素影响小，提取DNA的纯度稳定性很高，其缺点是当样品过量时，需反复进行离心，对样品的提取效率较低。
图2 离心柱法DNA提取过程示意图
磁珠法
将纯化介质包被在纳米级的磁珠表面，通过介质对DNA的吸附作用，在外加磁场的作用下使DNA附着于磁珠并定向移动，从而达到核酸与其它物质分离的目的。
图3 磁珠法DNA提取过程示意图
三种纯化方法的比较：
| 纯化方法 | 沉淀法 | 离心柱法 | 磁珠法 |
|---|---|---|---|
| 优点 | 样本处理体积灵活、产量高 | 操作简便、快速，更安全，产物纯度高可用于下游实验 | 通量高，可实现自动化操作，产物纯度高 |
| 缺点 | 安全性低，无法进行高通量提取且纯度较低 | 存在堵住风险，对样本起始量有限制 | 需要搭配使用磁力架，成本相对较高 |
| 选择依据 | 时间充裕，样本量相对充足 | 操作简便、省时，提取出的DNA可应用于绝大多数下游实验 | 下游需要高纯度的DNA进行自动化提取 |
DNA提取基本原则
保证DNA结构的完整性
DNA结构的完整性会根据下游实验的目的而有所区别。如PCR、Southern杂交这一类实验基本保证所需片段的完整即可，二代测序实验为了获得全面的序列信息对DNA的完整性要求较高，三代测序则要求DNA片段的完整性比二代测序更高。
保证DNA的纯度
去除对下游实验中酶分子有抑制作用的有机溶剂和高浓度金属离子；
将蛋白质、多糖、多酚等生物大分子的污染降到最低；
去除RNA（如RNA对后续实验的影响）。
常见问题解决方案
Q1. DNA降解
(1) 选择新鲜样本，减少内源酶的作用；
(2) 样本初始量不要超过所用方法的初始量标准；
(3) 样本避免反复冻融；
(4) 选择合适的处理方式并进行充分的样本前处理；
(5) 前处理结束后在样本解冻前添加裂解液；
(6) 正确添加所需试剂种类及使用量，样本量增加时裂解液也需成倍增加；
(7) DNA产物进行分装保存，避免反复冻融且保存时间不宜太久。
Q2. DNA产量低
(1) 对提取样本中DNA含量水平有一定了解；
(2) 选择合适的前处理及裂解方式（如延长裂解和DNA沉淀的时间等），尽可能的将样本中的DNA完全释放出来；
(3) 使用柱式试剂盒对DNA产物洗脱的时候，要尽量覆盖整个吸附膜；进行二次洗脱也可增加产量。
Q3. DNA纯度低
▶ 初始样本过量易导致裂解也不完全；
▶ 样本应进行充分裂解，特别是对于一些比较复杂、含有较多杂质（多糖、多酚等）的样本需进行特殊处理；
▶ RNA残留：使用RNase对RNA进行处理，处理时间不宜太短或太长（10 min左右）；
▶ 蛋白残留：使用蛋白变性剂或蛋白酶K；沉淀法分层吸取上清时注意不要吸到下层沉淀蛋白。
