养细胞的时候，支原体怎么清除？
发布时间：2023-12-21 浏览次数：346
在养细胞的过程中，总会有一些不速来客，它们总会不请自来，比如真菌、霉菌。但最令人头疼的还是支原体，它总是悄悄的来，对细胞造成极大的危害，今天就来认识一下支原体。
1 支原体是什么？
支原体是目前为止发现的最小的原核生物，具有以下特点：
1. 形态结构与细菌相似，但又比细菌小，是介于细菌与病毒之间的微生物；
2. 结构简单，只有细胞膜、细胞质、核糖体、DNA、可溶性RNA和一些其它细胞内含物，支原体的细胞器只有核糖体；
3. 没有细胞壁，具有多种形态，丝状、球状、扁平状等；
4. 体积小，最小的只有0.1μm，部分支原体可通过0.22μm滤器，但过滤器并不能完全去除支原体。
2 支原体如何危害细胞？
支原体污染一般在显微镜下不可见，很难察觉，但细胞会受到极大的损伤，主要通过以下途径影响细胞生长及功能。
3 支原体来自哪里？
1. 污染细胞支原体的种类
污染细胞的种类有在二十种以上，其中95%以上的支原体污染是口腔支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、莱氏无胆甾原体和猪鼻支原体五种。
2. 支原体污染的来源
a. 环境污染：如细胞培养房、细胞培养箱、超净工作台内已被支原体污染；
b. 实验器材的污染：移液枪、移液管、细胞培养皿、水浴锅等；
c. 细胞培养试剂的污染：培养基、胰酶、血清、细胞冻存液等；
d. 污染的原代细胞；
e. 操作人员操作带来的污染等；
3 如何预防支原体？
支原体危害这么大，我们应该如何应对？我们可以从以下几个方面预防支原体：
1. 定期消毒：定期对细胞房、实验服、移液枪、细胞培养箱等进行消毒，及时清除支原体；
2. 检查细胞培养试剂：选择来源可靠的试剂及耗材产品，在进行细胞培养操作之前，检查细胞培养基、血清、胰酶等试剂，可选择合适孔径的滤膜进行过滤除菌，使用过程中如发现有污染应及时更换；
3. 规范细胞培养操作：建立良好的细胞培养操作SOP，遵循无菌操作原则，规范穿戴实验服、口罩、手套等，并在细胞培养开始时进行消毒；规范处理实验废弃物；
4. 在培养基中加入支原体预防试剂：
加入抑制支原体DNA合成的抗生素：例如氟喹诺酮类抗生素；
加入抑制支原体蛋白质合成的抗生素：例如大环内酯类、四环素、双萜烯类等抗生素；
加入非抗生素类支原体清除试剂：如膜活性多肽，通过与支原体膜特异性结合彻底清除支原体。
4 支原体检测方法有哪些？
1.分离培养法：
检测方法：将待检样品接种到适合支原体生长的液体培养基或固体培养基中，如有支原体污染，液体培养基颜色会改变，固体培养基将会有菌落疯狂生长。
优点：该方法被称为支原体培养法的金标准，可以检测绝大多数支原体。
缺点：支原体生长到一定数量才能判断是否有污染，检测时间长，无法实现对支原体的快速检测
2.原位染色法：
检测方法：通过染色试剂（如DAPI、Hoechst 等）对待测细胞培养物进行染色，在荧光显微镜下观察待测样品的荧光判断支原体污染。
优点：可清晰直观的看到支原体微粒。
缺点：死亡细胞释放的DNA也会被染色，在支原体轻度污染时，较难判断是否有支原体污染。
3.化学发光法
检测方法：利用支原体特有酶的活性并通过ATP依赖的萤光素酶催化的发光反应进行检测，通过比较检测试剂加入前后ATP量的变化来确定样品是否有支原体污染。
优点：检测快速，仅需15min即可完成检测。
缺点：该方法只能检测活的支原体，如果支原体死亡，将无法通过ATP的变化判断支原体污染。
4.巢式PCR法：
检测方法：通过设计两对引物扩增支原体的DNA，第一对引物用于第一步PCR，用于初步判断是否有支原体污染；用第二对引物进行第二轮PCR，观察DNA条带用于鉴定是否有支原体污染。
优点: 通过两轮PCR可以大大提高检测的特异性和灵敏度，可根据扩增片段的大小大致预测支原体的种属。
缺点：操作繁琐，需要进行两轮PCR。
5.探针法qPCR：
检测方法：设计特异性引物和荧光探针，通过探针法qPCR高灵敏检测培养的细胞等生物材料中是否有支原体污染。
优点：灵敏度高，检测快速，可一次性检测大量样品，PCR扩增后无需电泳分析即可判断是否具有支原体污染。
缺点：该方法灵敏度很高，因此对实验环境要求较为苛刻，且需要精密的qPCR仪器。
6.等温扩增变色法：
检测方法：通过设计4-6对特异性引物，在一定的恒定温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物进行核酸的快速扩增，并且通过颜色变化而无需电泳分析即可确定是否有支原体污染。
优点：不需要反复的升温和降温，不需要精密的仪器，在恒定的温度下即可对核酸进行扩增。反应结束后，无需电泳分析，通过颜色变化即可判断是否具有支原体污染。
缺点：对引物要求较高，需要设计多对引物，且扩增产物不能用于测序。
5 细胞被污染，怎么办？
如果细胞被支原体污染，不要着急，也不要弃掉，我们可以及时清除支原体，对细胞进行挽救，减少支原体对细胞的危害。
1.及时更换培养液：可以减缓支原体的污染，但不能完全清除；
2.使用抗生素类去除试剂：抗生素对支原体有较好的抑制作用，可以有效清除支原体，但长时间使用抗生素，会产生耐药性的风险。在使用单一抗生素清除效果不佳时，可以考虑更换抗生素或者采用复合型抗生素试剂；
3.使用非抗生素去除试剂：非抗生素清除试剂不会产生耐药性，对支原体的清除效果可以达到100%，且几乎对细胞没有影响，是去除支原体的首选试剂。
4.实验室环境清洁：发生支原体污染后，应及时处理已被污染的细胞，并对细胞房进行彻底的清洁和消杀，防止交叉污染。
细胞培养过程中细菌和真菌污染其实也是很令人头疼的事情。除了在培养液中添加一定比例的抗生素外，也建议大家定期对细胞房、培养箱进行清洁除菌。
实验过程中，我们的细胞很珍贵，实验试剂也属实不便宜呢，虽说我们现在已经拥有了各种各样的支原体清除和除菌剂产品，但是避免污染的最好方式还是注意实验规范以及定期清洁，为了不给细菌、真菌、支原体卷土重来的机会，最好同时把实验环境中的污染源也一起消灭，最后希望大家的实验都顺顺利利，远离污染。
来源：环凯转载于“Super Lab”公众号；
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