想看懂方法验证(validation)报告，这些术语必学
发布时间：2024-08-14 浏览次数：2183
小六前段时间分别跟小伙伴们掰扯完了方法验证（validation）和方法确认（verification），介绍了国际上主流的方法验证规则概况。在上一期快速检验方法如何选择的文章里也提到了“充分的方法验证”非常重要。最近有小伙伴们后台留言，许多方法开发者都会给提供方法验证报告，但怎么判断方法算充分验证呢？
所以接下来小六跟大家一起分享一些充分验证需要做的实验要求，但前提是先要学习这些验证报告中涉及的“参数术语”，它们都代表什么意思。
所以本期跟大家分享关于ISO16140-2，AOAC通则，GB4789.45中涉及的重点术语和解释。
Validation
首先，需要了解这几个验证通则中涉及的词汇有哪些？
ISO16140-2:2016
定性验证主要参数：配对/非配对、灵敏度、相对检出限、包容性、排他性等。
定量验证主要参数：相对正确度、准确度、定量限、包容性、排他性等。
AOAC验证通则
定性验证主要参数：包容性、排他性、稳健性、重复性和再现性等。
定量验证主要参数：包容性、排他性、重复性、偏差和稳健性等。
GB4789.45验证通则
定性验证主要参数：灵敏度、包容性、排他性等。
定量验证主要参数：灵敏度、包容性、排他性、准确度等。
我们在报告里还会经常看到：参考方法/参比方法、食品基质、样品等术语。
重点术语详解
1、灵敏度(sensitivity)
待验证的定性方法从样品中检出目标微生物的能力。
灵敏度体现方法对于样品中极低污染水平(部分检出水平)的目标微生物的检出能力，较高污染水平的样品对于定性方法的验证并无太大意义。GB4789.45标准用检出限来表示定性方法的灵敏度。如果验证时无参考方法，待验证方法的灵敏度用LOD表示。如果验证时有参考方法，待验证方法的灵敏度用RLOD 表示。
小六看到在ISO16140-2中的灵敏度(sensitivity)研究的意思与GB4789.45中不一样，我们具体来看看！
ISO16140-2中的灵敏度研究的目的是确定参考方法和替代方法之间的灵敏度差异。灵敏度研究采用自然污染样品和(或)人工污染的样品。需对不同的类别(categories)和类型(types)的样品进行测试，用接受限进行评价。接受限(最大可接受的差异)取决于该灵敏度研究属于配对研究或非配研究和测试类别的数量。
这个疑问，小六在GB4789.45-2023《食品安全国家标准 微生物检验方法验证通则》实时指南中找到了答案：
国际上微生物检验方法验证中的灵敏度通常指部分检出水平样品的阳性符合率。食品安全国家标准微生物检验方法没有参考方法，可以计算阳性率，但是没有参考的阳性率，无法计算阳性符合率，因此食品安全国家标准微生物检验方法无法采用国际上通常使用的灵敏度。
2、包容性(inclusivity)
待验证方法对目标微生物的检出能力。
包容性与排他性一起构成特异性。包容性的验证不添加食品基质，体现了方法单纯的对目标微生物的识别能力。
3、排他性(exclusivity)
待验证方法对非目标微生物的抗干扰能力。
排他性的验证不添加食品基质，体现了方法单纯的不会将非目标微生物错误识别为目标微生物的能力。
包容性和排他性不添加食品基质，考核方法对目标微生物纯菌的识别能力。
4、检出限(limit of detection,LOD)
检出限是指获得一定概率阳性测试结果时的目标微生物浓度，是可以被检测但不能准确定量的最小浓度。需要注意的是，检出限不是检出与检不出的界限，而是一定概率检出时的浓度水平。
例如，LOD95是 95%检出概率的目标微生物浓度，在此浓度水平仍存在检不出的概率5%。定性方法检出限概率一般确定为 50%，即 LOD50。定量方法检出限概率一般确定为 95%，即LOD95，或简写为 LOD。
5、相对检出限(RLOD)
如果验证时有参考方法，待验证方法与参考方法两者 50%检出限的比值。ISO 16140-2:2016 中对于 RLOD 要求不高于 1.5。
定义中的检出概率规定为“50%”。实际上，不管检出概率是多少，待验证方法与参考方法两者检出限的比值不变。也就是说，RLOD是待验证方法与参考方法两者检出限(LOD)的比值，不一定非要 50%检出限的比值。
6、LOD50
定性方法检出概率为 50%时，样品中目标微生物的浓度。
LOD50用于在没有参考方法的情况下确定定性方法的灵敏度。越低的数值表明定性方法的检出能力越强。
定性方法的LOD50约为 0.7CFU。但是，由于食品基质的影响，通常高于LOD50 0.7CFU，也就是说实际上增菌开始的时候需要更多的目标微生物才能达到 50%的检出概率，目标微生物的生长受到食品基质的抑制。某些食品基质也可能使定性方法的LOD50低于0.7CFU，目标微生物的生长受到这些种类的食品基质的促进。
LOD50是用部分检出水平的样品进行试验推算出的，并不是样品实际要达到的浓度水平。制备检出概率为50%的样品是不可能实现的。实际情况是，制备一组部分检出水平（阳性检出率为 25-75% 之间）的样品或制备几个污染水平不同的样品(其中至少有一个污染水平为部分检出水平)，根据每个污染水平结果的阳性率和样品的初始污染浓度计算获得 LOD50。
LOD50与基质种类密切相关，不同基质种类通常有不同的LOD50。
7、部分检出水平(factional detection level)
采用定性方法测试一组平行样品时，检出概率在 25%~75%时样品的污染水平。
部分检出水平是样品中目标微生物的浓度水平需要满足检出概率在 25%~75%之间。GB4789.45中，部分检出水平的样品用于定性方法的灵敏度研究。
8、配对/非配对分析
两种定性方法同时检验某一样品时，若第一步增菌方法相同，可使用该样品的同一试样进行分析，该分析称为“配对分析”；若第一步增菌方法不同，则使用该样品的不同试样分别进行分析，该分析称为“非配对分析”。在ISO16140-2中主要用于替代方法的定性方法验证研究。
9、准确度(accuracy)
准确度指测试结果与真值(或接受参考值)间的一致程度。
当用于一组测试结果时，准确度由系统误差(偏倚)分量和随机误差(规定条件下的标准差)分量组成也就是说，准确度包含正确度和精密度。
准确度通常是针对定量方法来说的，但是定性方法重复测试获得检出率，将定性数据转化为了定量数据，定性方法也可以计算准确度。
10、相对正确度研究（Relative trueness analysis）
相对正确度研究是对参考方法与替代方法获得的结果之间的比较研究。
采用自然和/或人为污染的样品，对不同的类别、类型以及项目进行测试。使用Bland-Altman 方法分析，并绘制散点图，样品中超出差值的总平均值的 95%置信区间的样品数量不得高于 1:20的比例。
11、稳健性（robustness study）
测试方法保持不受微小但不能忽略的参数变化影响的能力所进行的研究，表明方法正常使用的可靠性。
比如，金葡测试片稳健性测试，采用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌株，制备高浓度、中浓度和低浓度菌液。各5次重复，在34、36和38°C温度下孵育24±2小时，以评估温度变化。采用类似的方案来评估孵育时间的变化，各5个重复，在36±1℃下孵育20、24和28 h。
一般方法经实验室间充分验证的方法，会略过此参数，因为实验室间的验证本身已经引入了很多不确定性的因素，故没有必要再重复稳健性测试。这就是为什么 AOAC- PTM 验证会进行稳健性测试，而 OMA方法一般不会测试该参数。
12、重复性（repeatability）
重复条件下的精密度。
在同一实验室，由同一操作人员使用相同的设备，在短时间间隔内，以相同的方法对相同的测试项目进行独立的测试。
13、再现性（reproducibility）
再现性条件下的精密度。
在不同实验室，由不同的操作员使用不同设备，按照同样测试方法，对同一测试对象相互独立进行的测试。
14、参考方法（Reference Method）
用于与待验证方法进行比较的现有公认分析方法。如ISO方法、GB4789系列方法、BAM方法等。
15、基质（Matrix）
依据方法的预期用途纳入确认的食品、饮料或环境表面材料等。
一般包括食品大类、子类（类型）、样品。
如：乳与乳制品（食品大类）、发酵乳（子类）、光明如实酸奶（样品，具体到产品本身）。
16、样品（Sample）
从重复测试部分中取出用以分析的样品基质。
样品（自然污染的、未污染的或接种的）含有的分析物（如有）应浓度均匀。
以上术语大家要好好学习哦！
下一期跟大家分享参照GB4789.45如何设计验证方案。
【参考文献/内容来源】
1、书籍：《食品安全国家标准 微生物检验方法验证通则》实时指南
2、ISO16140-2:2016 —替代（专有）方法对参考方法的验证协议
3、AOAC 国际方法委员会食品及环境表面微生物方法的验证指南（2012）
