婴儿奶粉中乳酸菌活细胞快速检测的进步：基于FCM法
发布时间：2024-08-26 浏览次数：270
乳酸菌：调节人体肠道菌群无形的手
乳酸菌是一类能将糖类发酵生成乳酸的益生菌，广泛存在于乳制品、发酵食品以及人体的消化道和生殖道中。它们在食品工业中常用于发酵酸奶、奶酪等产品。乳酸菌可以调节肠道菌群、促进消化吸收并增强免疫：如罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌可以治疗婴儿肠痛，因此在医学和营养学领域受到广泛关注。乳酸菌检测对于评估食品安全性、保证产品质量以及维护肠道健康至关重要。
FCM法：乳酸菌检测的主要操盘手
FCM法（Fluorescence Correlation Microscopy，荧光相关显微镜法）是一种基于荧光标记的显微技术，用于分析分子在溶液中的动态行为。通过检测荧光分子的荧光强度随时间的变化，FCM法可以提供分子浓度、扩散速度、相互作用等信息，广泛应用于生物化学和生物物理学研究。由于过去开发的LAMP，MALDI-TOF-MS法等或多或少都存在一些缺陷——如无法定量、时间成本高等，并且单独的FCM法不具有特异性，因此FCM法联用PMA和FISH便被开发出来。
1+1>2:多种生物技术的联用焕发的勃勃生机
对样品预处理后，使用PMA对活细胞进行染色，再利用特异性荧光探针（FISH）对活菌细胞进行荧光标记（该荧光探针为RNA探针LAB 158用于乳酸杆菌细胞的特异性染色）。通过固定步骤使用固定液(PFA)和透化剂改变样本通透性，进而进行杂交步骤，最后在流式细胞仪488nm处进行分析，乳杆菌细胞的定量则通过平板法测定实现。
排除艰难险阻：核心问题的优化
使用FISH方法必须越过的大山有一座，那就是采用增强探针的信号等手段优化染色过程提升杂交强度，目前总共有五大类手段来解决这一问题：一是提高探针浓度，此方法中对样品采用了消化处理，以消化其中的蛋白质和脂肪减少了杂质的数量，并且将乳酸菌细胞暴露于CHI这种广谱抗生素中以增加细胞rRNA含量。二是优化杂交条件，通常FISH方法的杂交温度为37°C到42°C之间，并且可以通过延长杂交时间来增强信号。该方法首先在不同杂交温度(36、38、40、42、44、46和48°C)下使用最终浓度约为109cells/mL的乳杆菌细胞悬液进行预实验最终确定了杂交温度为42°C时，相对FL强度最高，并辅以CHI。三是使用信号放大系统，常用的放大技术为TSA（Tyramide Signal Amplification），它利用辣根过氧化物酶（HRP）催化酚类化合物的聚合反应，将多个荧光分子沉积在探针结合的部位，从而显著增强信号，本方法使用的CHI亦是同理。四是使用更亮的荧光染料，如Alexa Fluor系列染料，比传统的FITC、TRITC等染料具有更高的荧光强度和光稳定性。五是减少背景噪声，通过调整洗涤液的盐浓度和温度去除未结合的探针和非特异性结合物或者在杂交前使用封闭剂（如牛血清白蛋白，BSA）处理样本，阻断非特异性结合位点，降低背景信号。在解决完这些核心问题之后，该方法被进行了活乳杆菌细胞定量的验证，并具有较好的特异性。PMA- Serfish -FCM法的TTR总计近2.5 h，其中预处理20 min, PMA染色10 min，寡核苷酸探针染色115 min, FCM分析5 min，新方法的TTR比传统的方法要短得多。
结论：该项研究提供了一种全新的婴儿配方奶粉质量检测思路，通过三种生物技术的结合有效增强了奶粉中活乳酸菌细胞检测特异性，提高了准确性并减少了时间成本，这一方法为乳酸菌活菌的检测手段提供了新的思路和可能性。但它也存在一些不足，如FCM技术所需的经济成本较高，手段较为繁琐。
原文doi：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c03742
来源：微生物安全与健康网，作者~雷晓旭
链接：https://www.mbiosh.com/column/testing-technology/testing-technology-method/28416
