粪大肠菌群酶底物法/纸片法 滤膜法 多管发酵法三种方法比对分析
发布时间：2025-06-20 浏览次数：57
以下是对粪大肠菌群检测中酶底物法/纸片法 、纸片法、滤膜法和多管发酵法三种常用方法的详细比对分析，涵盖原理、操作、优缺点和应用场景。
核心目标： 检测水样（或其他样品）中是否存在粪大肠菌群，即能在44.5±0.5℃下发酵乳糖产酸产气的大肠菌群细菌。它们是粪便污染的指示菌。
1. 多管发酵法 (Multiple-Tube Fermentation Technique, MTF)
水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法（HJ 347.2-2018）
原理： 基于统计学概率（最大可能数 - MPN）。将不同体积的水样（或稀释液）接种到一系列含有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。经过初步发酵（产酸产气为阳性）、复发酵（确认试验）和耐热性试验（44.5℃培养）来证实粪大肠菌群的存在并估算其数量（MPN值）。
操作流程：
1，初发酵： 将不同体积的水样（如10mL, 1mL, 0.1mL）或稀释液接种到单料或双料乳糖蛋白胨发酵管中，35-37℃培养24±2小时。
2，观察产气： 观察发酵管产酸（溴甲酚紫指示剂变黄）和产气（杜氏小管内有气泡聚集）。记录阳性管数。
3，复发酵（证实试验）： 将所有产酸产气的发酵管或仅阳性管转种到EC培养液或亮绿乳糖胆盐肉汤中。
4，耐热性试验： 将转种的EC管置于44.5±0.5℃水浴或培养箱中培养24±2小时。
5，结果判断： 观察EC管是否产气。产气者即为粪大肠菌群阳性。
6，结果计算： 根据初发酵阳性管（或经复发酵证实的阳性管）的组合，查MPN表得到每100mL水样中粪大肠菌群的最可能数（MPN/100mL）。
优点：
标准方法： 是许多国家和组织的标准方法，仲裁性强。
灵敏度相对较高： 尤其适合检测菌群密度较低的水样（如清洁水源）。
能处理浑浊或有色水样： 对样品的物理性状要求相对较低。
能估算活菌数量： 提供MPN值。
缺点：
操作繁琐： 步骤多（初发酵、复发酵、耐热性试验），耗时长（总培养时间约48-54小时）。
耗材量大： 需要大量玻璃器皿（发酵管、试管、吸管等）和培养基。
结果非精确计数： MPN是统计学估计值，置信区间较宽，精确度低于滤膜法。
主观性： 产气判断（尤其是少量气泡）可能存在主观性。
占用空间大： 培养和操作需要较大空间。
主要应用场景：
◑ 饮用水、水源水等水质标准的法定检测。
◑ 浑浊度较高、有颜色或有干扰物质的水样。
◑ 菌群密度较低的水样。
◑ 需要仲裁结果的场合。
2. 滤膜法 (Membrane Filtration Technique, MF)
水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法(HJ 347.1-2018）
原理： 将一定体积的水样通过孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，细菌被截留在滤膜表面。将滤膜转移到选择性培养基（如M-FC培养基）上，在44.5±0.5℃下培养24±2小时。粪大肠菌群菌落呈蓝色（因发酵乳糖产酸使培养基中的苯胺蓝指示剂变蓝）。
操作流程：
1，样品准备： 水样可能需要稀释（若预期菌落过多）。
2，过滤： 在无菌条件下，将已知体积的水样（通常100mL或适量稀释液）通过无菌滤器中的无菌滤膜（0.45μm）进行抽滤。
3，转移滤膜： 用无菌镊子将截留有细菌的滤膜转移到吸饱M-FC培养基的衬垫上（或直接放在含M-FC培养基的平皿中）。
4，培养： 将平皿置于44.5±0.5℃的培养箱中培养24±2小时。
5，计数： 计数滤膜上生长的蓝色菌落（粪大肠菌群）。
6，结果计算： 根据过滤水样体积和计数的菌落数，计算每100mL水样中的粪大肠菌群数（CFU/100mL）。
优点：
快速： 总时间短（约24-26小时），能更快获得结果。
结果精确： 直接计数菌落形成单位，结果更直观、精确（CFU值），比MPN法离散度小。
可处理大体积水样： 能浓缩水样中的细菌，提高低浓度水样的检测灵敏度。
耗材相对较少： 主要耗材是滤膜和培养基。
可同时检测多个指标： 同一水样可过滤多张膜用于不同项目检测（如总大肠菌群、粪大肠菌群）。
缺点：
对水样要求高： 浑浊度高、悬浮物多、藻类多的水样会堵塞滤膜，影响过滤速度和准确性，必须先进行预处理（如絮凝沉淀）。
背景干扰： 某些非目标菌也可能生长或产生类似颜色，需要经验鉴别（M-FC选择性已较好，但仍需注意）。
设备投入： 需要真空泵、滤器、恒温水浴（精确控温44.5℃）等设备。
菌落重叠： 高浓度水样可能导致菌落重叠，影响计数准确性。
操作需规范： 过滤操作需严格无菌，转移滤膜需小心避免损伤。
主要应用场景：
◑ 相对清洁、低浊度的水样（如处理后的饮用水、地表水、地下水、游泳池水）。
◑ 需要快速获得精确计数结果的常规监测。大体积水样中低浓度细菌的检测。
3. 酶底物法/纸片法 (Defined Substrate Technology, DST / Enzyme Substrate Test, 常称纸片法)
水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法（HJ 1001-2018）
水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法(HJ 755-2015)
原理： 使用含有特定营养底物和指示剂的预制培养基片（纸片、小袋、小管或孔板）。粪大肠菌群特有的酶（主要是β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶）能水解底物，释放出发色团或荧光团，使培养基产生特定的颜色变化（如由黄色变蓝绿、变红）或荧光。培养温度通常为35-37℃（检测总大肠菌群）或44.5℃（检测粪大肠菌群）。
操作流程 (以常见水样纸片为例)：
1，加样： 用无菌吸管或注射器将规定体积（通常1mL或10mL）的水样加入含有预制干燥培养基的纸片袋（或小瓶/孔）中。,
2，封口/混合： 密封袋口（或盖紧盖子），充分混匀，确保水样浸润培养基。
3，培养： 将接种好的纸片袋（或小瓶/孔）置于恒温培养箱中培养。检测粪大肠菌群需在44.5±0.5℃培养24小时。
4，结果判读： 观察培养基颜色变化（或荧光）。根据说明书判断阳性（颜色变化/有荧光）或阴性（无颜色变化/无荧光）。阳性纸片袋/孔的数量可用于估算MPN值（查厂家提供的MPN表）或直接报告为“检出”/“未检出”（定性）。
优点：
操作极其简便： 步骤少（加样-培养-判读），无需配制大量培养基和灭菌大量器皿。
快速： 培养时间通常24小时。
便携性好： 试剂盒体积小、重量轻，特别适合现场快速筛查或资源有限地区。
不易受杂菌干扰： 选择性底物设计使其特异性较好，背景干扰少，结果判读相对客观（颜色变化明显）。
标准化： 商品化试剂质量稳定，减少人为操作误差。
废物少： 产生的固体废物较少。
缺点：
定量精度有限： 主要用于定性或半定量（MPN估计），精确度不如滤膜法（CFU计数）。
MPN表覆盖范围可能有限。
成本较高： 单位测试成本通常高于传统的多管发酵法和滤膜法（耗材成本）。
检测限： 通常只能检测1mL或10mL样品体积，对极低浓度水样的灵敏度不如能浓缩大体积的滤膜法。
对水样浊度/颜色敏感： 浑浊或有色的水样可能干扰颜色判读。
标准化依赖厂商： 方法性能高度依赖特定商品试剂盒，不同品牌可能有差异。
仲裁性： 在一些法规标准中可能不作为仲裁方法（但认可度在提高，如EPA已批准部分DST方法）。
主要应用场景：
◑ 现场快速检测和应急监测（如灾后、野外）。
◑ 中小型实验室或资源有限实验室的常规筛查。
◑ 食品、饮料等非水样中大肠菌群的快速检测（原理相同，培养基配方可能调整）。
◑ 需要简便操作和快速定性结果的场合。
三种方法关键特性对比总结表
结论与选择建议：
1、追求法定性、仲裁性、处理复杂水样（浑浊/低浓度）： 首选多管发酵法 (MTF)。
2、追求快速、精确计数结果（CFU），处理清洁/低浊度水样： 首选滤膜法 (MF)。
3、追求操作简便、快速筛查、现场检测、资源有限环境： 首选酶底物法/纸片法 (DST)。
在实际工作中，选择哪种方法取决于具体的检测目的（定性/定量/仲裁）、水样特性（浊度、预期菌浓度）、可用时间、实验室设备条件、成本预算以及相关法规或标准的要求。有时也会结合使用，例如用纸片法进行快速初筛，阳性样品再用MTF或MF法进行确认和定量。
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