工程院食品安全院士团队

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大肠杆菌（Escherichia coli， E. coli）是一种常见细菌，常见于许多温血哺乳动物的胃肠道。产志贺毒素的大肠杆菌（shiga toxin-producing E.coli, STEC）菌株，最常见的是大肠杆菌O157：H7，可导致人类严重的传染性疾病，包括腹泻、胃痛和炎症每年，STEC估计在全球范围内导致2，801，000例急性疾病、3890例血友病性尿毒综合征、270例永久性终末期肾病和230例死亡，主要影响婴儿和幼儿。在资源有限的国家和地区，情况尤其严峻。例如，撒哈拉以南非洲地区的一项研究显示，71%的家庭水样检测出大肠杆菌呈阳性。大肠杆菌污染，这需要快速、灵敏且具有成本效益的监测方法。在加拿大，30.3%的人口依赖地下水作为家庭用水。确保地下水的安全强调了开发负担得起的快速敏感监测方法的必要性。

传统的监测方法，例如乳胶凝聚、基于细胞培养的方法和聚合酶链反应，提供了有关污染的准确信息。然而，这些方法通常依赖于集中的设施以及适当的采样和运输，这会导致快速响应的严重延误。许多生物传感技术都是为了快速测试各种材料而开发的。生物传感器通常通过监测分析物与生物传感元件的反应来检测分析物的浓度，这会导致光学、电气或测色特性的可测量变化。最近，几种生物传感器也被用来检测大肠杆菌，主要基于化学发光强度的信号变化、表面增强拉曼光谱学、表面声波的共振频率和阻抗。

例如，Khang等人开发了一种能够通过掺入氧化石墨烯/铁纳米复合材料和鸟苷化学发光在一小时内对大肠杆菌进行检测，检测限为4500 FU/ml。同样，Sun等人创建了一种微流控化学发光生物传感器，该生物传感器使用改进的Turkevich方法和紫外可见吸收光谱法将检测限达到130 FU/mL。该方法使用10 μL的样本体积，并在1.5 h内完成测试。

另一种有前途的生物传感器技术是微波传感，它可以根据材料的电性质（包括介电常数和导电率）区分材料。如果感兴趣的分析物，例如E.大肠杆菌以悬浮在液体样本中的形式或与涂在微波电极上的传感元件结合的形式存在于传感器区域中，则可以改变传感区域的电性质（即介电常数），从而导致反射系数的可测量变化。微波传感已被证明可以有效检测水样中的重金属、通用培养基和唾液溶液中的SARS-CoV-2病毒以及固体培养基上的细菌生长。

研究人员之前开发的用于检测SARS-CoV-2病毒的微波生物传感器表现出与市售快速检测试剂盒相当的性能。在设计的微波传感器中，传感器表面涂有一层针对SARS-CoV-2病毒的特异性抗体，与病毒结合进行检测。大肠杆菌O 111菌株在luria-bertani培养基中检测，达到1000菌落/mL的检测限。尽管检测限与其他电化学传感器相当，但仍有空间进一步降低检测限并提高实际现场测试的便携性。此外，应在饮用水样本中测试大肠杆菌O 157：H7菌株，以验证传感器在现实世界应用中的能力。

近日，滑铁卢大学机械和机电工程一体化工程专业Carolyn L. Ren团队在Biosensors and Bioelectronics期刊上发表了题为：A functionalized microwave biosensor for rapid, reagent-free detection of E. coli in water samples的论文。

为解决上述问题，本研究在这项工作中，研究人员提出了一种新颖的、具有成本效益的微波生物传感器来检测大肠杆菌。水样中的大肠杆菌O 157：H7。微波传感器涂有一层薄薄的金，制造在印刷电路板（printed circuit board, PCB）板上，用大肠杆菌特异性抗体进行功能化。杆菌提出的微波生物传感器具有高传感性能，特异性和灵敏度得到验证，可实现647 FU/ml的检测限。该传感器能够灵敏地检测大肠杆菌。大肠杆菌在各种水系统中存在，其低成本和便携式尺寸证明了其适合广泛应用于水质监测。

传感器设计和传感机制的示意图如图1所示。这种大肠杆菌微波生物传感器的关键组件包括在PCB基片上制造的开口环共振器（split ring resonator, SRR）和使用双面胶带粘合到PCB基片的聚二甲基硅油模具。SRR的内环和外环的半径分别为6.5 mm和8.5 mm。内环有1 mm的小电容间隙。在PDMS基片中设计了一个穿通孔，作为容纳用于测试的样本的容器。储液器与微波传感器对齐，使得内回路的电容间隙位于储液器的中心，如图1所示。传感器区域涂有一层针对大肠杆菌O 157：H7菌株的抗体。

图1 微波生物传感器和传感机制示意图。通过将微波传感技术和生物材料相结合，该传感器旨在专门检测大肠杆菌。大肠杆菌O157：H7。为了确保特异性，在微波传感器表面涂有一层针对O 157：H7菌株的特异性抗体。当大肠杆菌O 157：H7存在于容器中并在测试过程中与抗体结合时，微波共振频率将随着局部介电常数的变化而发生移动。这种频移可用于证明大肠杆菌的存在并确定其数量。

研究人员接下来使用高频结构模拟器（HFSS）通过数值模拟对传感器设计进行了优化，具体尺寸如图2（a）所示。仿真模型和仿真结果的示例分别如图2（b）和（c）所示。该传感器设计为具有约1 GHz的工作共振频率，以便通常具有较窄工作频率范围（例如50 GHz-1.5 GHz）的手掌大小的便携式VNA可用于现场测试。该拟议传感器的设计参数经过调整，以显示尖锐、灵敏的共振，这是传感的理想选择。该设计中的传感区域为内环间隙区域，其中电场的最大幅度显示在图2（d）中。优化的传感器是在PCB基片上制造的，与研究人员之前开发的在玻璃基片上制造微波共振器的方法相比，这显着降低了制造所需的成本和时间。

因此，本发明的微波传感器可以以低成本批量生产。传感器表面镀金，以增强导电性并防止氧化。将SubMiniature版本A（SM）连接器焊接到传感器，然后用于与载体网络分析仪（VNA）连接。

图2 (a)微波传感器的尺寸为R₁ = 6.5 mm，R₂ = 8.5 mm，l₁ = 1 mm，l₂ = 3 mm。(b)微波生物传感器的仿真模型（c）传感器的S₁₁频率响应。(d)电场分布显示了电容间隙区域中的敏感区。

微波感测依赖于存在于储存器中的大肠杆菌样品与储存器底部的微波传感器之间的结合。为了确认发生结合，使用扫描电子显微镜检查了暴露于大肠杆菌样本和未暴露于大肠杆菌样本的传感器表面，如图3所示。图3（a）显示了传感器表面，该传感器表面涂有大肠杆菌抗体，然后与10⁷ FU/mL大肠杆菌接触。100 min后，通过除去储液器中的溶液来干燥传感器，并立即使用扫描电子显微镜进行检查。如图3（a）所示，扫描电子显微镜聚焦于传感器区域。在传感器表面上可以清楚地观察到大肠杆菌的存在，大肠杆菌以圆柱形结构存在于传感器表面上。在图3（b）中，其示出了未暴露于大肠杆菌样品的传感器表面。两种传感器的比较表明微波生物传感器上的抗体包被能够捕获大肠杆菌。

图3 传感器表面大肠杆菌的扫描电子显微镜图像(a)用大肠杆菌处理（放大2000倍）和（b）不用大肠杆菌处理（放大2000倍）。

为了确保微波传感的特异性，对几个对照组进行了一系列测试。首先，为了验证抗体的功能，比较了有和没有抗体涂层的传感器，如图4（a）所示。当用大肠杆菌样本处理时，没有抗体涂层的传感器没有显着的频移。相比之下，抗体涂层传感器在响应大肠杆菌样本时具有明显的频移。这证实了包被的抗体可以有效地捕获目标大肠杆菌，导致传感区域附近的介电常数发生变化，从而产生频移，而没有抗体包被的传感器无法捕获目标大肠杆菌样本，这些样本保持悬浮在缓冲溶液中。

另一项对照测试是用不同类型的细菌进行的，包括目标大肠杆菌O 157：H7，另一种大肠杆菌。大肠杆菌、BL 21和细菌S.金黄色。由于包被在传感器表面上的抗体对大肠杆菌O 157：H7具有特异性，因此传感器应该仅在响应大肠杆菌O 157：H7的存在时表现出频移。如图4（b）所示，以不同浓度（10⁴至10⁷ CFU/ml）测试三种细菌。研究人员观察到大肠杆菌BL 21和S的频移可以忽略不计。所有测试浓度下的金黄色葡萄球菌表明它们对O 157：H7大肠杆菌抗体没有反应。在O 157：H7大肠杆菌的浓度范围内观察到可测量的频移，并且频移随着O 157：H7大肠杆菌样本的浓度而增加，这是预期的，因为样本浓度越高，表面上发生的结合事件越多，导致介电常数的变化，从而导致频移。

图4 大肠杆菌检测对照组（a）用于107 CFU/ml大肠杆菌检测的抗体包被和裸传感器（b）使用O 157抗体包被传感器的不同细菌组与O 157大肠杆菌。

研究人员还通过测试溶解在去离子水中的不同浓度的大肠杆菌样本来进行大肠杆菌的检测。测试了五种不同浓度的O 157：H7大肠杆菌样本，范围为10³ - 10⁷菌落总数/mL。图5描述了100 min时不同浓度大肠杆菌样本对应的共振频移。在传感期间，O 157：H7大肠杆菌通过与抗体的特异性结合被捕获在传感器表面上。作为积累的结果，传感器附近的溶液的介电常数改变，导致微波谐振频率偏移。图5（a）显示具有最高浓度的样品导致8.75 MHz的频移，而具有较低浓度的样品随后具有较小的频移。同样使用与对照组相同的抗体涂覆传感器测试去离子水，并且显示出可忽略的频率偏移。所有这五个浓度组的频移均显著大于去离子水对照组。在图5（b）中，进行线性分析，显示出优异的线性。结果表明，共振频移可能与大肠杆菌的浓度相关。根据实验数据的线性分析，在去离子水中测试时，该微波生物传感器的检测限为647 FU/ml。

图5 去离子水中不同浓度的大肠杆菌检测。数据在100分钟时采集。数据以平均值±标准差表示，n = 5。与对照组（去离子水）相比，*P < 0.0001进行统计分析。(a)103 - 107 FU/ml不同浓度去离子水中大肠杆菌的传感结果。(b)大肠杆菌传感结果的线性分析。

这项创新旨在对水中大肠杆菌进行快速、灵敏的检测，作为水质监测的一种手段。日常水样与去离子水不同，去离子水通常含有更复杂的成分，例如盐离子和其他细菌，这可能会影响传感性能。因此，为了测试微波生物传感器的实际适用性，将大肠杆菌O157：H7溶解在从安大略省原住民家庭获取的每日水样中制备溶液。其余测试程序与去离子水中相同。

如图6（a）所示，测试了五种不同浓度的大肠杆菌，其显示出与去离子水中的趋势相似的趋势。在家庭用水中溶解有大肠杆菌的样品都显示出可测量的频率偏移，表明大肠杆菌被传感器表面上的抗体捕获。还测试了不含大肠杆菌的家庭用水样品，与大肠杆菌试验相比，其显示出可忽略不计的变化。对于每个浓度，频率偏移略大于DI水中的频率偏移。这是由于家庭用水中存在的物质。家庭水样中大肠杆菌的最高浓度导致频率约为9.5 MHz，10³ FU/ml大肠杆菌样本在100 min时引起2.4 MHz的频移。图6（b）描述了家庭水中大肠杆菌传感结果的线性分析，并呈现出良好的线性。

图6 家庭用水中不同浓度的大肠杆菌检测。数据在100 min时采集。数据以平均值±标准差表示，n = 5。与对照组（去离子水）相比，* P <0.0001进行统计分析。(a)10³ - 10⁷ FU/ml不同浓度去离子水中大肠杆菌的传感结果。(b)大肠杆菌传感结果的线性分析。

便携性和低成本是开发用于现场测试和快速应对新爆发的生物传感器时需要考虑的重要因素。如果包括VNA在内的整个系统紧凑、具有成本效益，那么所提出的微波生物传感器将得到广泛使用。用于上述测试的VNA（ANRITSU MS 2028 C）价格昂贵（~ 50，000加元）且体积庞大，需要通过墙壁插头供电，不适合敏感、经济实惠且便携式的现场使用。

研究人员探索了使用低成本手掌大小的NanoVNA（约70加元）（如图7（a）所示）使用微波传感器进行测试的可行性。传感结果如图7（b）所示。便携式VNA能够检测五种不同浓度大肠杆菌的微波生物传感器的频移。大肠杆菌溶解在去离子水中。随着大肠杆菌的增加，可以观察到共振频移增加的趋势。大肠杆菌浓度。此外，Nano-VNA结果与常规VNA的性能相当。值得注意的是，Nano-VNA和常规VNA之间最大的区别之一是它们的频率范围。普通VNA最高可达20 GHz频率，而Nano-VNA最高可达3 GHz。该传感器设计在1 GHz左右工作，因此适合使用Nano-VNA。上述结果证明了该传感器系统用于水质监测的实用性。研究人员尝试使用Nano-VNA检测家庭水样中的大肠杆菌，这未能成功证明重新设计传感器以及更高分辨率Nano-VNA是合理的，这超出了本研究的范围。

图7 使用便携式载体网络分析仪检测大肠杆菌（a）设备图片和信息，以及（b）Nano-VNA和常规-VNA之间的比较。

综上所述，本工作开发了一种新型的微波生物传感器，可以快速、经济有效地检测大肠杆菌，这是频繁监测水质以防止大肠杆菌爆发所迫切需要的。拟议的传感器已通过验证，可检测去离子和家庭水样中的大肠杆菌，以及作为便携式设备的可行性，这表明其具有现场检测的能力。该传感器已被证明对大肠杆菌O157：H7具有特异性，对去离子水中大肠杆菌的检测限为647 FU/ml。如果集成预浓缩工艺，则可以进一步降低至6.47菌落数/mL。令人鼓舞的结果展示了这种微波生物传感器用于水系统中大肠杆菌检测的潜力和光明前景，可广泛用于水质监测和未来保护人类健康。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117334

来源：微生物安全与健康网，作者~段子璇。