厌氧培养没有菌落怎么办？厌氧菌不生长原因与排查方法
发布时间：2026-09-07 浏览次数：19
培养结束后没有菌落，最直接的判断往往是菌株活性不足。但翻看完整的实验记录就会发现，影响结果的不只有菌株。培养基是否处于还原状态、接种后在空气中停留了多久、厌氧罐有没有漏气，甚至培养皿在罐内怎样摆放，都可能改变结果。因此，单凭一次“不生长”很难确定问题所在。比较有效的办法，是先看阳性对照和厌氧指示结果，再顺着实验过程往前查。这样既能缩小范围，也可避免在同一条件下反复试验。
先看培养基，而不是先换菌株
厌氧培养基不仅要提供营养，还要维持适合目标菌生长的氧化还原状态[1]。已经配好的培养基如果长时间接触空气，或在保存过程中反复受热，原有状态可能发生变化。开始接种前，可以先观察颜色、透明度和液面情况，再对照批号、有效期及配制记录。若外观已经异常，继续接种的意义并不大。
以环凯FTM培养管为例，官网资料显示，其配方中的硫乙醇酸钠和L-胱氨酸具有降低氧化还原电位的作用，刃天青则用于指示培养基的氧化还原状态[3]：氧化时呈粉红色，还原时为无色。观察颜色可以提供线索，但不能替代培养基适用性检查和阳性对照。
图1：环凯FTM培养管（CP8033G2），可结合颜色和培养基外观辅助检查培养基状态。
表1：问题及思路
| 培养现象 | 先查看什么 | 排查方向 |
|---|---|---|
| 阳性对照未生长 | 培养基颜色和厌氧指示 | 培养基状态或厌氧环境 |
| 菌落数量明显偏少 | 复苏、稀释和接种记录 | 菌株活性或空气暴露时间 |
| 同批平板差异较大 | 平板摆放和冷凝水 | 罐内装载或培养温度 |
| 连续多批结果异常 | 密封圈和供气记录 | 设备密封或气体系统 |
菌株复苏正常，不代表接种过程没有问题
有些试验的培养基和设备均无明显异常，问题却发生在接种过程中。严格厌氧菌在复苏、稀释、涂布和转移期间不断接触空气，暴露时间越长，对培养结果的影响越难排除[2]。实验开始前备齐培养皿、稀释液和接种工具，可以减少中途等待。
冻干菌株的复苏也需要留意。选择性培养基和显色培养基常含有抑制成分，并不一定适合直接复苏状态较弱的菌体。可先用合适的非选择性培养基复苏，以便观察菌落形态和培养物纯度。
如果阳性对照能够正常生长，而样品始终没有菌落，问题更可能出在样品前处理、接种量或样品基质。反过来，阳性对照也不生长，就不宜马上把样品判为阴性，此时需要回头检查培养基、复苏过程和厌氧条件。
罐盖已经锁紧，不等于厌氧环境合格
厌氧罐看似结构简单，实际使用中仍有不少容易忽略的细节。密封圈使用时间过长、罐盖没有均匀锁紧、培养皿装得过满，或者产气剂与罐体容积不匹配，都可能留下残余氧。仅凭“已经封罐”不能确认内部环境合格，还应结合厌氧指示结果进行判断。
图2：厌氧罐应与适配的产气剂配套使用，并检查密封状态。
使用厌氧工作站时，检查重点有所不同。舱体是否密封、气瓶余量是否充足、供气压力是否稳定，以及物料进入后是否完成环境平衡，都与培养结果有关。气体比例不能照搬一个固定数值，应依据目标菌株、设备要求和实验室已经确认的方法设置。
用标准菌株判断问题出在哪一段
没有阳性对照时，样品不生长究竟代表“未检出”，还是培养体系没有正常工作，很难分清。标准菌株的价值就在于为这两种情况提供参照。菌株复苏和传代仍需按照产品说明书及实验室菌种管理程序执行。
图3：环凯产气荚膜梭菌ATCC 13124定性质控标准菌株，可作为培养体系排查的参照。
当标准菌株、培养基和厌氧系统同时设置对照后，问题范围会明显缩小：对照菌株不生长，应检查培养基、复苏及环境；对照正常而样品异常，应回到样品处理和接种环节；罐式培养异常而工作站培养正常，则应重点检查密封与产气系统。
复盘一次失败的厌氧培养时，不妨把培养基批号、复苏时间、封罐时间、厌氧指示变化和设备状态放在同一张记录表中。标准菌株也不生长，先查培养体系；标准菌株正常而样品异常，再回到样品处理环节。
参考文献：
[1] Speers, Allison M., Cologgi, Dena L., Reguera, Gemma. Anaerobic cell culture. Current protocols in microbiology, 2009, Appendix 4.
[2] Lawson, Paul A., Tanner, Ralph S. Cultivation of anaerobic bacteria: Foundations and principles. Anaerobe, 2025.
[3] Petiti, J., Revel, L., & Divieto, C. Standard Operating Procedure to Optimize Resazurin-Based Viability Assays. Biosensors, 2024, 14(4).
