铜绿假单胞菌斜面保存应室温还是冷藏？标准依据、验证方法与实操建议
发布时间：2026-09-14 浏览次数：13
同行业很多老师问铜绿假单胞菌斜面保存是在室温还是2-8摄氏度，翻遍《中国药典》和现行国标，找不到一句直接规定斜面保存温度。不同一实验室，做法都不一样：一种做法进 2~8℃ 冷藏，一种置室温，各自的理由无非"菌种常规冷藏"与"该菌冷藏易失活"。
本文核对的材料包括：《中国药典》通则、两份行业标准、一份省级地方标准、中检院菌种使用说明书，以及部分期刊文献。结论方向明确，但能站住的边界同样清楚。
一、先界定所保存的对象属于哪一层级
"菌种"在实验室中至少存在三种形态，保存要求彼此不同，实践中常被合并为一条通用规则。
| 层级 | 形态 | 明文要求 |
|---|---|---|
| 标准菌株（0代菌种） | 未启封的冻干安瓿/西林瓶、或者不同菌种保藏中心的形态 | 以中检院说明书为例：暂不启开的安瓿可置于 2~8℃ 保藏（绝大部分为冻干状态） |
| 标准贮备菌株 | 复活后转种、恢复优良特性 | ChP 9203：建议 −30℃ 以下、液氮或冻干 |
| 工作菌株 | 斜面／平板上的新鲜培养物 | ChP 9203 未规定温度 |
补充："2~8℃"写在冻干安瓿那一层级，是对斜面的要求。冻干品要求冷藏，目的是维持真空封装的干燥状态；斜面含水分与营养、承载活菌，保存机理不同。以同一温度区间覆盖两类对象，属经验沿袭。
二、药典将温度的决定权交给了谁
《中国药典》2025 年版四部通则 9203 对菌种保藏的要求为程序性要求：方法应标准化，防止污染、防止生长特性改变。至于斜面在何种温度下保存多久，该通则未给出数值，仅规定如下：
标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。
据此，决定权落在两项依据上：所使用菌种的供应商说明书，以及本实验室的验证数据。后续讨论均以此为前提。USP ⟨1117⟩ 与 GB 4789.28 在同一事项上亦为原则性表述，均未给出斜面的具体保存温度。因此，若主张"药典规定菌种斜面必须 2~8℃"，应要求其提供相应条款号。
三、两份标准将铜绿单独列出，写明"室温"
（1）SN/T 2632—2010《微生物菌种常规保藏技术规程》，附录 A 定期移植保藏法 A.4.4.1 保藏温度：
培养好的菌种于 4℃~6℃ 保存，有些菌种（如：部分弧菌、假单胞菌等）4℃~6℃ 容易死亡，适于 25℃ 室温保藏。
该条采用"通则 + 例外"结构：前半句为通则，例外由后半句规定。对假单胞菌而言，构成操作要求的是后半句。此点在检查应对中较为关键，因对方可能引用前半句主张"标准要求冷藏"。
（2）DB14/T 3466—2025《制药企业质量控制 菌种保存使用技术要求》（山西省地方标准），7.2.1 斜面保存法第 4) 条：
铜绿假单胞菌置室温避光保存，其它菌种置 2℃~8℃保存，均应直立放置。
两份标准构成接续关系：行业标准规定的是属级"假单胞菌"，地方标准将其落实到种级"铜绿假单胞菌"，且面向制药企业质量控制场景。
不止斜面：该标准的液体石蜡保存法（7.2.2 第 5) 条）同样写明"铜绿假单胞菌置室温避光保存，其它菌种置 2℃~8℃ 保存"。室温处置不是斜面单条，而是这份地标对铜绿假单胞菌的系统性立场。
需要说明的是：SN/T 属出入境检验检疫行业标准，不属药典体系；两份标准均不能单独作为制药 GMP 的合规依据。其定位是有力佐证，而非最终依据。
四、"斜面必须冷藏"的现行标准存在内在矛盾
唯一明确要求"斜面冷藏"的现行行业标准，是 WS/T 683—2020《消毒试验用微生物要求》（国家卫生健康委员会）5.2.1.1：「传代用菌种采用斜面冷藏保存。」
但同一节 5.2.1.3 随后规定：「一般存储时间不超过 9 周，铜绿假单胞菌和分枝杆菌不超过 6 周。」同一节内，一方面统一要求冷藏，另一方面将该菌期限由 9 周缩减至 6 周。该差异表明，标准制定者已考虑其冷藏失活相对更快。
机制上亦可解释。铜绿假单胞菌 4℃ 不生长、42℃ 生长，属其鉴别特征；多份资料指出该菌在 4℃ 易发生菌体自溶而死亡，冷激本身亦可造成损伤：低温下可培养数下降，其中相当一部分转为"活的但不可培养"（VBNC）状态。该状态并非死亡，但平板计数无法检出，在促生长试验与阳性对照中的表现与死亡菌无区别。
另需注意适用范围：WS/T 683 面向消毒试验、用于评价消毒剂效果，不属药品微生物检验领域。将其直接作为药品放行依据，属超出适用范围引用。
五、必须说明的证据空缺与结论上限
在完成现有文献检索后，有一点明确：尚无文献就"铜绿假单胞菌斜面：室温与 4℃差异"做过存活率的头对头比较。该空缺是本议题客观存在的，并非检索覆盖不足所致。
期刊文献可支持的范围仅限两点：一是室温下该菌可以存活（天然矿泉水体系中接种 10² CFU/mL，4~5 天增长 3 个 log，该水平维持至第 70~100 天，其中一株存活满 5 年）；二是 4℃ 下应缩短保存期。
中文文献中有三项与斜面场景更为贴近。戴宇婷、刘自昭（《中国卫生标准管理》2019, 10(5): 69-71）以制药端常用的 CMCC(B)10104 等标准菌种为对象，在 9 种菌中仅将铜绿假单胞菌改为室温保存，期限为室温低于 10℃ 时缩短、10℃ 以上可保存 2~3 个月；同批金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌仍按 2~8℃ 保存。何小丽等（《福建医药杂志》2006, 28(3): 130-131）提供的是 4℃ 数据，载体为半固体琼脂（0.25%）：3 个月内复苏生长良好，6 个月后存活率降低、仅达 30%，蓝绿色色素消失，需连续传代 3~4 次方恢复。刘英等（《中国病原生物学杂志》2009, 4(9): 716, 669）以斜面与高层半固体为对象：3 个月性状无明显改变，半年后存活率降低、色素不明显，1 年后全部死亡；该文未标注保存温度。三项研究的载体与温度各不相同，不可互相套用，但共同指向一点：此类载体的有效保存期以"月"计，冷藏并未延长其寿命。
另有反证须同时列出，否则构成引用上的选择性：有研究比较了三株铜绿假单胞菌在 −20、0、4、25、37℃ 下的可培养性，结论为无显著差异。该结果决定了结论上限：可表述为"室温保藏不违背该菌的生物学特性"，不可表述为"室温优于冷藏"。
还有一个流传较广的解释：铜绿在 4℃ 不生长，而它的噬菌体在这个温度下活性很强，所以菌数往下掉；室温铜绿的活性比噬菌体强，此消彼长，所有较好存活。但因为没有找到相关的文献（也可能没翻国外文献），不做重点解释。
补一层方法学依据：国家卫健委 2026 年发布的 WS/T 900—2026《病原微生物菌（毒）种保藏质量控制 通用标准》明确，保存方法应及时查新和验证、应根据菌（毒）种类别及特性选择适宜方法，必要时以两种以上方法并存。这与 9203 的精神一致，正好落在下面要说的自验证方案上。
六、实操建议与自验证方案
1. 以菌种说明书为第一顺位依据。这是 ChP 9203 明文授权的路径。需注意，中检院说明书"暂不启开的安瓿可置于 2~8℃ 保藏"针对的是未启封冻干安瓿，不适用于斜面。另需说明，供应商口径并不统一：有厂商的通用条款写斜面 2~8℃，同时将该菌单列为 10~20℃；亦有厂商在同一产品页给出两档有效期，2~8℃ 为 1 个月、15~25℃ 为 2 个月。故"依说明书执行"本身即可能指向两种结论。
2. 采用冷藏方案时，效期应从严掌握。铜绿假单胞菌斜面有效期建议不超过 1 个月，不宜套用其它菌种 3 个月的惯例，并应单独完成一次存放效期验证。
3. 采用室温方案时，条件须明确固化。15~25℃、避光、直立、密封防干，不得置于开放台面；冬季温度低于 10℃ 会缩短保存期，故宜使用可控温培养箱。
4. 验证项目应覆盖活菌数与生长特性、纯度、色素（绿脓素／荧光素）产生、生化特性，以及传代不超过 5 代的特性一致性。
5. 记录中应写明保存温度与方式。ChP 9203 要求每支菌种注明保藏位置和条件，该项在实际检查中最常被追问。
如需自行填补上述证据空缺，方案并不复杂：取同一批斜面培养物、同代次同菌龄，分两组，分别置 2~8℃ 与 20~25℃；于第 0、1、2、4、8、12 周各取一支，检测活菌数与生长特性、纯度、色素及生化特性，记录两组各自的失效时间点。该结果即为本单位、该菌株、该培养基的有效期依据，在检查中的证明力高于任何文献。
