基于PfAgo的无扩增SERS生物传感器实现鼠伤寒沙门氏菌快速高灵敏现场检测
发布时间：2026-05-25 浏览次数：12 分享：
食源性疾病是全球严重的公共卫生挑战，其中鼠伤寒沙门氏菌因其广泛分布和高致病性备受关注。传统的检测方法如平板培养和ELISA往往耗时且灵敏度有限，而作为金标准的qPCR虽然灵敏，却依赖复杂的扩增步骤，易导致假阳性且不便现场应用。近年来，CRISPR/Cas等基因编辑工具虽在分子诊断中展现出潜力，但仍受限于PAM序列要求及对预扩增的依赖。因此，开发一种无需扩增、操作简便且能实现高灵敏度现场检测的新型生物传感平台，对于保障食品安全和公共健康具有迫切需求。
本研究开发了基于PfAgo介导的无扩增表面增强拉曼散射（PAF-SERS）生物传感技术，通过利用PfAgo蛋白在单链DNA引导下特异性识别并切割沙门氏菌基因组，产生特异性连接DNA片段，进而桥联磁珠与SERS纳米探针，将核酸识别信号转化为可定量的拉曼信号。研究详细优化了PfAgo反应体系（蛋白浓度、引导序列、反应时间）及SERS检测体系（磁珠用量、金银纳米粒子比例），并结合支持向量机（SVM）算法对光谱数据进行深度分析。该方法成功解决了传统检测及CRISPR技术依赖核酸扩增、操作复杂及易产生假阳性的问题，实现了无需扩增、高灵敏（10 CFU/mL）、快速（55分钟内）的病原菌检测。
结果与讨论
PCAF-SERS传感机制的验证与构建：利用PfAgo在5′-P ssDNA引导下特异性识别并切割鼠伤寒沙门氏菌基因组，产生特异性连接DNA，桥联磁珠与SERS纳米探针，通过TEM、DLS和紫外吸收表征验证各步骤成功构建，证实了该无扩增检测策略的可行性。
图 1 PAF-SERS生物传感器的示意图。A：SERS纳米探针的制备。B：鼠伤寒沙门氏菌基因组的提取及Pf Ago切割反应。C：混合反应后SERS信号的检测。D：感染小鼠中检测的示意图。
PfAgo反应体系的优化与验证：系统考察PfAgo蛋白浓度、引导序列类型及反应时间对靶标切割效率的影响，通过琼脂糖凝胶电泳分析产物条带强度，确定100 nM PfAgo、5′-P引导序列、37℃反应60 min为最佳条件，确保靶标被高效切割以产生最大检测信号。
图 2 PAF-SERS生物传感器的优化。A-J：对PfAgo浓度、gDNA浓度、Ago反应时间、Ago生成量和MB浓度的优化试验。K-L：不同AgNPs@PVA比例下基于AuNP的SERS纳米探针的性能优化。
SERS检测平台的构建与参数优化：利用连接DNA介导磁珠与SERS纳米探针的组装，通过优化磁珠用量及金银纳米粒子比例，调控“热点”密度，结合拉曼光谱强度筛选最佳信号增强条件，显著提升检测灵敏度与信噪比。
图 3 PAF-SERS传感器的灵敏度与性能评估。A-B：10-107CFU/mL沙门氏菌基因组的拉曼信号强度和吸光度，（I-I：阳性样本的拉曼值－阴性样本的拉曼值）。C：基因组拉曼信号强度的线性拟合，浓度为10-107CFU/mL。D-E：针对沙门氏菌的特异性验证。F-G：PAF-SERS的重复性验证。H-I：PAF-SERS的重现性验证。
PAF-SERS方法的临床样本检测性能评估：利用PAF-SERS传感平台对临床粪便样本进行盲测分析，结合SVM算法处理拉曼光谱数据，通过与qPCR金标准方法对比，计算灵敏度、特异性及准确率，验证了该方法在实际临床诊断中的可靠性与应用潜力。
图 4 在30个加标样品中，PAF-SERS与qPCR检测性能的比较。A：利用机器学习算法优化随机样本拉曼信号的示意图。B：qPCR-SYBR Green、qPCR-TaqMan和PAF-SERS的热分析图。+和 - 分别表示阳性样本和阴性样本。C：invA基因的ROC曲线分析。D：30个加标样品的比较与统计分析。E：拉曼法与qPCR法的箱形图对比。F-G：PAF-SERS与qPCR的Bland-Altman图。H-I：PAF-SERS与qPCR之间的相关性。J-K：PAF-SERS与qPCR方法的桑基图。
传感器的灵敏度评估与SVM分析：在最优条件下检测不同浓度沙门氏菌基因组，利用支持向量机（SVM）算法处理特征拉曼光谱数据，建立浓度-信号响应模型，实现10–10⁷ CFU/mL范围内的线性检测，验证方法的半定量能力与高灵敏度。
图 5 PAF-SERS用于检测鸡蛋、牛奶和鸡肉加标样品。A：PAF-SERS平台用于实际样品检测的示意图。B-G：PAF-SERS平台直接检测加标食品样品的结果。H-J：三种食品样品检测结果的线性拟合。
体内感染模型的动态监测与病理验证：利用鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠模型，通过定时采集粪便、血液及脏器样本，结合PAF-SERS技术动态监测病原体载量变化，同步检测IL-6、CRP、TNF-α等炎症因子水平，并通过组织病理切片观察结肠、脾脏、肝脏的损伤情况，验证了该传感平台在活体感染早期诊断、病情进展评估及治疗效果监测中的实际应用价值。
图 6 基于PAF-SERS生物传感器对小鼠模型中鼠伤寒沙门氏菌的检测。A:小鼠感染模型的建立及粪便样本采集与处理示意图。B-C：小鼠粪便中的拉曼检测信号，不同时间点的检测结果。D：不同时间点小鼠粪便中的浓度。E-F：基于PAF-SERS检测感染小鼠的结肠和盲肠。G：感染小鼠模型的建立及血液样本采集与处理示意图。H-I：小鼠血液中不同时间点的拉曼检测信号。J-M：小鼠血液中三种细胞因子（IL-6、CRP、TNF-α）及中性粒细胞在不同时间点的浓度。N：结肠、盲肠、肝脏和脾脏样本的HE染色图像，显示感染的影响。
总结：本研究构建的PAF-SERS传感平台具有三大核心优势：一是检测性能卓越，通过SVM算法处理拉曼光谱数据，灵敏度、特异性与准确率均优于传统qPCR方法，AUC值达0.995；二是检测流程高效，无需核酸扩增步骤，结合纸基设备实现样本到结果的快速检测，大幅缩短检测时间；三是实际应用性强，在临床粪便样本盲测中与qPCR金标准高度一致，且适用于复杂基质样本检测，为食源性致病菌的即时诊断提供了可靠的技术支撑。
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2026.142193
来源：微生物安全与健康网，作者~牛婧媛。
