食品混样检测沙门氏菌，采用不同方法验证其准确性和一致性
发布时间：2024-12-25 浏览次数：543
来源：环凯转载于“ 六扇门Study”公众号，作者~SIXDoors
近期在研究混样检测可行性时，小六查询到一篇关于食品中沙门氏菌混样检测方法的验证的文章《Validation of test portion pooling for Salmonella spp. detection infoods》，摘录部分重点内容跟大家分享。
这个实验是为证明不同食品基质中沙门氏菌检测，混样（最大375g）增菌检测与参考的25 g单独增菌检测方法是否存在等效性。比较不同食品基质，不同检验方法（培养 、ELISA和RealTime PCR）在检出概率为50%时的检测限(LOD50)。
验证规则：
选择了6大类食品样本，23种不同的食品基质（根据ISO 16140-2：2016附件A中选择），基本可涵盖全球范围内的食品类别。
每种食品基质共测试40个重复。制备了20个单个测试部分(25g参考样本量）和20个混合试测试部分(375g替代样本量），三个接种水平（低、中、高），每个接种水平做2个重复。
验证方案
菌株添加、操作流程等
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1、菌株添加
不同食品基质中添加的沙门氏菌血清型如下表。
不同菌株分别从冷冻培养液中转移并培养。
用于接种不同基质的菌株需要提前模拟亚致死状态操作，即：50°C的水浴中孵育10分钟。通过比较选择性琼脂（XLD培养基）上的菌落数量（CFU）与非选择性琼脂（TSA培养基）上的菌落数量（CFU），估算菌株热损伤程度。
热损伤程度在43%~68%之间，与ISO 16140-2：2016要求一致。
2、实验操作
将375g混合样本和25个单独样本，分别加到3375mL和225mLBPW（已经提前预热到37°C）中，均质2min。在37°C±1°C中培养，16h至24h（时间长短取决于不同方法）。
注意：对于含有益生菌的食品，需将10 mg万古霉素溶解于10 ml无菌水中 使用0.22µm的过滤膜进行过滤后，将10ml的万古霉素原液加入到1000 ml的BPW中。
方法1:培养法，参照 ISO 6579:2002，
前增菌培养16 h-20 h后，使用RVS进行选择性增菌，20h-24h后进行平板分离，测定菌落浓度。
整体时间预计：（16 h-20 h）+（20h-24h）+（18 h-24 h）
方法2:GDS法，专有方法
前增菌培养16 h-20 h后，进行磁珠富集和荧光PCR检测。
整体时间预计：（16 h-20 h）+（2h-2h）+（1.0h-1.5h）
方法3:TPSG法，专有方法
前增菌培养16 h-20 h后，使用RVS进行选择性增菌，之后用ELISA试剂盒检测。
整体时间预计：（16 h-20 h）+（18h-24h）+（1.0h-1.5h）
方法4:VIDAS ICS-SLM法，专有方法
前增菌培养18 h-24 h后，使用VIDAS中进行自动免疫浓缩，在41.5±1.5°C下继续培养5-6h后，采用VIDAS进行自动检测。
整体时间预计：（18 h-24 h）+（5h-6h）+（1.0h-1.5h）
方法5:VIDAS Easy SLM法，专有方法
前增菌培养16 h和22 h后，使用专用培养基，在41.5±1.5°C下孵育22 h -26 h，之后采用VIDAS进行自动检测。
整体时间预计：（16 h-22 h）+（22h-26h）+（1.0h-1.5h）
不同检验方法前增菌培养时间要求如下表：
专有检验方法，已被验证过的检出限如下表：
结果分析
检出限、检出率
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1、不同方法检出限测试结果
采用最长增菌时间培养方案进行测试，23种食品基质种有21种测下下来，RLOD50 < 2.5，是可以接受的。
在所有测试方法和条件下，只有一种食品（N° 19巧克力酱）结果不佳，可能与含有抑菌成分有关，还需要进一步研究。
2、最长和最短前增菌时间的研究
为了研究最短和最长前增菌时间对混样及单个测试结果的影响，实验对每种方法和食品基质都进行了LOD50测试。对25 g样品进行的460个计算，有15个在最短和最长前增菌时间后的LOD50值均为>1 MPN。然而在最短前增菌时间时，混样增菌的LOD50>1 MPN的两倍（如下图），显然，当使用最短的前增菌时间时，混合样本的LOD50更高。
与 25 g单一测试相比，375 g混样测试的最短和最长预增菌培养时间的 LOD50 值不同，这可能是因为某些食品微生物生长受阻有关。
事实上，假设微生物在前增菌的培养液中随机分布，“为了确保在1ml预增菌培养物中至少可被转移1个目标菌，要求每ml培养物中至少平均存在7个活菌。” (Jarvis, 2007)。
考虑到沙门氏菌在37°C下的最大指数生长期µ = 0.8-0.9 log cfu/ml/h（Juneja和Marks，2006，Zheng等人，2013），混合样品（375 g在3.750 L）将比（25 g在225mL）至少需要多培养1.3h-1.5h，才能达到大致相同的浓度。
这种差异可能会对亚致死热处理损伤的沙门氏菌的假阳性率产生很大影响，其中滞后期可能大于4h (Juneja and Marks, 2006)，并且对于存在背景菌群或抑制剂的样品也是如此。
3、不同方法阳性检出率结果
前增菌24h后（最长时间），测定了沙门氏菌的检出水平（log10cfu/ml）。结果表明，在5 log10 cfu/ml的水平下，测试方法均可检出（95%为阳性） ，在浓度为3 log10 cfu/ml的情况下，无论方法如何，82%的样品检测出沙门氏菌阳性。
实验结论
🌟对于多种食品基质，375g混样增菌后，无论采用何种检测技术，LOD50结果是可接受的，并且与25g单检和375 g混样，经过验证具有很好的一致性。
🌟在所有测试的方法和条件下，只有一种食品（N° 19巧克力酱）结果不佳，可能与含有抑制成分有关，还需要进一步研究。
🌟前增菌培养的时间越长，检测结果表现出更好（具有高LOD50的基质数量较少）。
🌟前增菌后沙门氏菌的最终浓度对不同方法的阳性检出率没有较大影响。
