原创 | 菌株的概念分类和保存
发布时间：2025-06-30 浏览次数：34
1 菌株的慨念分类
1.1、概念
标准菌株：即0代菌种，是指从官方菌种保藏机构获得并至少定义到属或种的水平的菌株。
标准储备菌株：从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准贮备菌株。
储存菌株：储存菌株通常从冻干或超低温保存的标准储存菌株进行制备。
工作菌株：标准储备菌株或储存菌株经继代培养后得到的菌株。工作菌株不可替代标准菌株。
标准培养物：标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。
商业派生菌株：与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业衍生物。
1.2、商业派生菌株
商业派生菌株是标准菌株的商业衍生物，最常见的商业派生菌株有广东环凯的定量工作菌株。在中国药典2015版9203指导原则里面有提到“药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株”，也有关于可以使用合格的商品化菌株的描述“Cultures for use in compendial tests should be acquired from a national culture collection or a qualified secondary supplier”。随着技术的进步与发展，微生物实验室稳定、高效的需求，用于质控的商业化定量工作菌株的广泛应用定是必然趋势。
商业派生菌株要求相关特性与标准菌株等效，除此之外，还有关键一点就是“可以溯源”。微生物"溯源"通常包含两层意思，一是指程序、途径合法有序，来源和去向清晰可控；另外是技术层面的佐证，比如株水平的鉴定识别等。这两个层面互为补充支撑，以保证菌种准确无误、合法有效。
2 菌株的保存
2.1、 常用保存方法
短期保存：营养琼脂斜面法 (4°C)
步骤：
▶ 将新鲜培养物划线或穿刺接种于无菌营养琼脂斜面。
▶ 于合适温度（通常37°C）培养至良好生长（通常16-24小时）。
▶ 斜面长出新鲜菌苔后，旋紧试管盖或用无菌胶塞密封（确保透气）。
▶ 贴上标签（菌株编号、日期、操作人），置于4°C冰箱。
保存期： 1 - 3个月（因菌种差异极大）。
优点： 操作简单、复苏快。
缺点： 易污染、易变异、保存时间短、需频繁传代。
关键点： 使用新鲜培养物；密封防干涸；定期检查存活状态。
中长期保存：甘油冷冻管法
步骤：
▶ 制备50%无菌甘油溶液（用去离子水或生理盐水配制，121°C灭菌15分钟）。
▶ 取对数生长后期的新鲜肉汤培养物（OD~600~ ≈ 0.6 - 1.0）或适量无菌生理盐水菌悬液。
▶ 将菌悬液与50%甘油溶液等体积混合（终甘油浓度~25%）。或直接将菌苔刮入含灭菌甘油的成品管（如下图的环凯甘油保存管）中混匀。
▶ 分装至无菌、预标记好的冷冻管（如1.5ml或2ml Cryovial管）中（通常0.5 - 1ml/管），立即置于超低温冰箱保存。
保存期： 1 - 10年或更长（视菌种而定）。
优点： 保存时间长、操作相对简单、遗传稳定性较好、复苏率高。
缺点： 依赖超低温C冰箱、复苏需解冻。
关键点： 确保菌体处于对数生长期（活力最佳）；甘油浓度准确（过高抑制，过低冰晶损伤）；混合均匀；快速冷冻（可先放-20°C 1-2小时再转-80°C）；避免反复冻融。
长期保存：冷冻干燥法（冻干法）
步骤 (简述)：
制备保护剂：常用脱脂牛奶、蔗糖、海藻糖等。
制备浓菌悬液：取新鲜培养的菌苔，悬浮于适量保护剂中（浓度约108-1010CFU/ml）。
分装：将菌悬液分装至无菌冻干安瓿瓶中（0.2 - 0.5ml）。
预冻：将安瓿瓶置于-40°C至-80°C快速预冻。
冷冻干燥：将预冻好的样品放入冻干机，在真空下升华除去水分（通常需数小时至数十小时）。
封口：冻干结束后，在真空或充氮气条件下用火焰熔封安瓿瓶。
储存：将封口后的安瓿瓶置于4°C或-20°C避光干燥处长期保存。
保存期： 10 - 30年或更长。
优点： 保存时间极长、遗传稳定性好、占用空间小、便于运输。
缺点： 设备昂贵、操作复杂、成本高、部分菌种复苏率可能较低。
关键点： 保护剂选择与灭菌；菌悬液浓度；预冻速度；冻干程序优化；严格无菌操作；安瓿瓶封口质量。
2.2、通用操作规范与注意事项
1. 无菌操作： 所有步骤必须在无菌条件下进行（超净工作台/生物安全柜）。
2. 菌株状态： 使用新鲜、对数生长期、纯培养物进行保存。保存前需确认纯度（镜检、平板划线）。
3. 标签标识：清晰标注菌株唯一编号、保存日期、保存人姓名、保存方法。
使用防水、耐低温的标签和记号笔。
冷冻管标签应能耐-80°C低温。
4. 记录管理： 建立详细的菌种保存登记本或电子数据库，记录保存信息（菌株信息、保存方法、位置、数量、复苏记录等）。
5. 备份原则： 重要菌株应至少采用两种不同方法保存（如甘油管+冻干），并分置于不同地点（如同一冰箱不同层或不同冰箱），防止设备故障导致全部损失。
6. 避免反复冻融： 冷冻保存的菌株（甘油管、冻干粉、液氮管）一旦解冻复苏，不得再次冷冻保存。应重新从原代保存管取菌培养后进行新一轮保存。
7. 定期检查：
4°C斜面：每周检查有无污染、干涸。
-80°C冰箱：记录温度，定期除霜维护。每年抽样复苏检查代表性菌株。
