双层平板法：微生物检测中噬菌体与抗生素效价测定的核心技术解析
发布时间：2025-07-17 浏览次数：36
双层平板法也是一种倾注平板法。
在微生物发酵过程中，尤其是大肠杆菌发酵，经常遇到噬菌体污染，借助显微镜也可以直观地观察，但不能测定，或精确地证明噬菌体的存在，双层平板法就是一种常用的方法，可以很精确地测定噬菌体的效价。
很多时候，想到噬菌体效价测定就能想到双层平板法，提到双层平板法就只想到噬菌体测定。但，还有一类重要的试验也要用到双层平板法-抗生素抗性测定，抑菌圈，用到的都是双层平板，一起学习一下。
一、定义：双层平板法，又叫双层琼脂平板法，顾名思义，两层固体培养基的平板，具体是指由一个培养皿内倒入底层固体培养基和上层固体培养基形成的双层平板，进行检测噬菌体或其他抗性的过程就叫双层平板法。
二、原理：先在培养皿中倒入底层固体培养基，待其凝固后倒入含有检测菌的上层培养基，经培养后，上层培养基会发生变化，比如说出现噬菌斑或抑菌圈或其他，以此来计算噬菌斑的数量，测定抗生素效价等。
三、双层平板法的应用1-噬菌体的分离培养
1.试验详细操作步骤
(1)配制底层培养基和上层培养基
底层培养基琼脂粉含量：1.5%-2%。
底层培养基培养基：无菌水加1.5%-2%琼脂粉，灭菌，待冷却至50℃倒平板，凝固后备用。
上层培养基琼脂粉含量：1%。
上层培养基培养基：根据检测菌种进行确定，灭菌后放入水浴锅中，备用。比如说，检测噬菌体，可以选用LB固体培养基。
(2)倾倒上层培养基
一般情况，待测样品为噬菌体污染的样品。
①取培养基：取出上层培养基，冷却至45℃左右。
②取样品：用移液器取样品0.5mL放入上层培养基中。
③取试验菌：接着用移液器吸取大肠杆菌菌液0.2mL，也放入上层培养基中，沿壁摇匀。
④倾倒平板：将上述混合液快速倒入底层培养基上面，凝固。
(3)培养：上层培养基凝固后，放置于恒温培养箱中倒置培养。
(4)观察，计算。
2.操作技巧：
(1)底层培养基不宜太厚，覆盖培养皿底部即可。
太厚上层培养基无法倒入，太薄不能覆盖培养皿底部，起不到应有的作用。
(2)上层培养基灭菌完成后，要摇匀放入水浴锅中，间隔沿壁摇动。
经常摇动，培养基不容易出现结块。
(3)水浴锅温度调至60℃，温度不宜太高或太低。
温度太高，想用的时候冷却较慢；温度太低，凝固的又太快。
(4)上层培养基温度降至45℃左右，再加入污染菌液和试验菌。
这个温度既能保证培养基和菌液混匀，又能保证不凝固不结块。
(5)上层培养基要沿壁摇匀，尽量避免产生气泡。
气泡太多，噬菌斑锯齿状，很难看。
(6)控制好试验菌浓度。一般正好覆盖一层菌液为好。
3.注意事项：
(1)酒精灯旁边操作，时刻保持无菌意识。
(2)双层平板法相对厚度不易把握，一定要看准，不能溢出或太厚。
(3)试验结束一定要将无关物品从超净工作台中取出，该灭菌的物品一定要灭菌后再处理，避免交叉污染。
(4)试验过程中，尽量减少人员流动。
四、双层平板法的应用2-抑菌圈牛津杯试验
抑菌圈研究法中使用最多的主要有K-B法、牛津杯法和打孔法。这里，我们学习一下牛津杯法。
1.试验详细操作步骤
(1)配制底层培养基和上层培养基
操作同上。
(2)放牛津杯
用镊子夹取牛津杯，依次放置于底层培养基上面，根据需要确定牛津杯数量，一般9cm培养皿放置4-6个牛津杯。
(3)倾倒上层培养基
①取培养基：取出上层培养基，冷却至45℃左右。
②取试验菌：用移液器取试验菌种0.2mL放入上层培养基中。
③倾倒上层培养基：将上述混合液快速倒入底层培养基上面，凝固。
④取样品：接着用移液器吸取样品适量，直接放入牛津杯中。
(4)培养：上层培养基凝固后，放置于恒温培养箱中培养。
(5)观察，计算。
拿走牛津杯，测量抑菌圈直径，计算。
2.操作技巧
(1)放置牛津杯时，轻轻压一下。
有固定位置的意思，但不能压碎底层培养基。
(2)根据需要放置牛津杯，不宜放置过多。
太多，抑菌圈重叠，无法计算和观察；太少又浪费空间。
(3)放好牛津杯后，尽量不再挪动位置，以免牛津杯侧倒。
实际上牛津杯在底层培养基表面，并没有固定位置。
(4)倾倒上层培养基动作既要轻又要快。
动作太猛容易冲倒牛津杯，太慢培养基容易凝固。
(5)底层培养基凝固后才能倾倒上层培养基，上层培养基凝固后才能培养。
(6)估测待测样品浓度或做多个对照组，确定样品加入量。
3.注意事项
(1)试验过程中用到的所有物品都要灭菌，包括牛津杯、镊子等。
(2)底层不宜太厚，铺平培养皿底部即可。
(3)用完的牛津杯和检测平板都要灭菌。
(4)试验过程中，尽量减少人员流动。
五、双层平板法的优势
1.加入底层培养基后，可弥补培养皿底部不平或超净工作台面不平，这样有利于后续试验观察。
2.形成的噬菌斑和抑菌圈清晰可见。
3.操作比较繁琐。
4.操作有一定难度。
5.因试验所需时间较长，对实验环境要求较高，容易污染。
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