革兰氏染色结果时阴时阳？避开这个关键陷阱，准确率立马飙升
发布时间：2025-10-31 浏览次数：63
革兰氏染色自1884年由丹麦细菌学家 Hans Christian Gram 创立以来，一直是微生物学中最基础且广泛使用的细菌分类技术之一。该染色法根据细菌细胞壁的结构与化学组成差异，将细菌分为革兰氏阳性（G⁺，紫色）和革兰氏阴性（G⁻，红色/粉色）两大类。然而，在实际操作中常出现染色结果不一致的现象，即“革兰氏可变性”（Gram variability）。这类细菌挑战了“非阴即阳”的二元分类观念，需通过机制理解与操作优化以实现准确判读。
一、革兰氏染色的基本原理
革兰氏染色的关键区别在于细胞壁结构：
革兰氏阳性菌：具有厚而致密的肽聚糖层（含大量磷壁酸），可有效保留结晶紫-碘复合物，抵抗酒精脱色。
革兰氏阴性菌：肽聚糖层薄，且具外膜结构，结晶紫-碘复合物易被酒精洗脱，最终被复染剂染成红色。
二、革兰氏可变性的机制
可变性并非基因型改变，而是细胞壁结构因生理或环境因素发生的暂时性变化，导致染料保留能力下降。常见机制包括：
1. 细胞壁结构完整性丧失：
老化细胞中肽聚糖交联度降低，磷壁酸含量减少；
自溶酶（如溶菌酶）活性上升，水解肽聚糖网络。
2. 培养条件影响：
营养耗竭（如碳、氮源不足）妨碍细胞壁合成；
酸性代谢产物积累导致环境pH下降，破坏肽聚糖稳定性；
使用抑制细胞壁合成的抗生素（如青霉素）可诱导结构缺陷。
3. 生长阶段差异：
对数生长期细胞壁完整，染色典型；
稳定期或衰亡期细胞易因自溶或结构松弛而脱色。
三、常见革兰氏可变性细菌举例
菌属 | 典型特征 | 可变性表现 |
|---|---|---|
| 芽孢杆菌属 | 粗大G⁺杆菌，产芽孢 | 老化后多数变为G⁻，但常保留芽孢结构 |
| 梭菌属 | 厌氧G⁺杆菌，产芽孢 | 易因细胞壁自溶呈现G⁻，如艰难梭菌 |
| 棒状杆菌属 | 多形态，常呈栅栏状排列 | 新鲜时为G⁺但不均匀，老化后更易变G⁻ |
| 放线菌属 | 分枝状丝状G⁺菌 | 老菌丝或某些种属易呈弱阳性或G⁻ |
四、实验操作中避免误判的策略
1. 使用新鲜培养物：
选择18–24小时（对数生长期）的菌体进行染色，避免使用超过48小时的老化培养物。
2. 优化培养与染色条件：
使用营养丰富的培养基（如血平板），避免使用成分抑制性强的选择性培养基；
严格控制脱色时间（酒精作用15–30秒），以流出液无色或淡紫色为终点。
3. 辅助形态与生化鉴定：
注意观察芽孢、菌体排列等形态特征；
可疑菌株可进行3% KOH拉丝试验：G⁺菌通常无拉丝现象，G⁻菌则因DNA释放呈黏液拉丝。
4. 多重方法验证：
结合抗酸染色、分子鉴定（如16S rRNA测序）等方法提高分类准确性。
结论：革兰氏可变性揭示细菌细胞壁的动态性质，提醒操作者需在标准化条件下进行染色，并结合多种特征进行综合判断。理解其机制不仅有助于提高实验室鉴定的准确性，也为研究细菌应对环境压力的生理适应提供了视角。
参考文献 ：
1）Gram, H.C. (1884). Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten. Fortschritte der Medizin, 2: 185–189.
2）Beveridge, T.J. (2001). Use of the Gram stain in microbiology. Biotechnic & Histochemistry, 76(3): 111–118.
3）Smith, A.C., & Hussey, M.A. (2005). Gram stain protocols. American Society for Microbiology.
4）Bartholomew, J.W., & Mittwer, T. (1952). The Gram stain. Bacteriological Reviews, 16(1): 1–29.
5）Davies, J.A., et al. (1983). Gram variability in Bacillus spp. depends on growth conditions. Journal of Bacteriology, 156(2): 846–855.
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