霉菌培养空白总长菌怎么办？
发布时间：2025-11-27 浏览次数：30
霉菌培养箱空白长菌（即无样品的空白对照长出霉菌 / 杂菌），核心原因是培养箱内存在污染残留、无菌操作不当、空白载体本身带菌或环境空气二次污染。以下是按 “排查优先级” 整理的原因分析、解决方案及预防措施，兼顾实验室实操性和可执行性：
一、先做 3 个快速排查（1 天内定位核心问题）
1. 空白载体本身是否带菌？（最易忽略）
排查对象：空白培养皿、培养基、无菌水、封口膜等耗材。
验证方法：
直接将未开封的空白培养皿（或刚配制的无菌培养基）不放入培养箱，在超净台内密封培养（同条件温湿度），若仍长菌→耗材本身污染；
若仅放入培养箱的空白长菌，超净台内培养的空白无菌→污染来自培养箱或操作过程。
解决方案：
◆ 更换合格耗材（选择有灭菌合格证的一次性培养皿，自制培养基需 121℃高压灭菌 20min，冷却后立即使用）；
◆ 培养基灭菌后避免长时间暴露在空气中，分装时超净台风速≥0.3m/s，紫外线消毒 30min 后再操作。
2. 培养箱内是否有可见污染残留？（最常见原因）
排查重点：
● 内胆角落、搁板缝隙、门封条褶皱处是否有霉斑、培养基残留、水渍；
● 湿度发生器（加湿器）水箱是否有浑浊、异味（滋生霉菌 / 细菌）；
● 通风口、过滤器是否堵塞或发霉（部分培养箱有 HEPA 过滤器，需检查是否失效）。
验证方法：用无菌棉签擦拭内胆、门封条、搁板，涂抹在空白培养基上培养，若长出与空白相同的菌→培养箱内残留污染。
3. 操作过程是否引入污染？（人为因素）
排查场景：
● 放入 / 取出空白时，培养箱门打开时间过长（超过 30 秒），环境空气进入；
● 操作人员手、手套接触空白培养皿边缘或开口；
● 超净台未消毒（或紫外线灯失效），分装空白时引入杂菌。
验证方法：同一批空白，分两组操作 ——A 组超净台内快速密封后放入培养箱，B 组在普通环境下打开皿盖 10 秒再密封，若 B 组长菌、A 组无菌→操作 / 环境空气污染。
二、针对性解决方案（按污染来源分类）
1、培养箱内残留污染（核心处理步骤）
彻底清洁消毒（分 3 步，避免残留）：
第一步：物理清除。断电冷却后，用无菌棉签蘸取 75% 酒精（或 0.5% 次氯酸钠溶液）擦拭内胆、搁板、门封条，重点清理霉斑和培养基残留（搁板可取出用高压灭菌锅灭菌，或用 80℃烘干箱烘烤 2 小时）；
第二步：深度消毒。关闭箱门，开启紫外线灯照射 60 分钟（确保紫外线灯未过期，亮度≥70μW/cm²），或用 “过氧化氢熏蒸”（实验室常用：30% 过氧化氢按 10-15mL/m³ 体积，加热熏蒸，密闭 24 小时后通风）；
第三步：湿度系统消毒。排空加湿器水箱，用 5% 柠檬酸溶液浸泡水箱 + 管道 30 分钟，清水冲洗 3 次后，注入无菌水（每周更换 1 次，避免水箱滋生霉菌）。
检查并更换 HEPA 过滤器（关键！）：
若培养箱有进气 HEPA 过滤器（过滤精度≥0.3μm），用尘埃粒子计数器检测出风口，若粒子数超标（≥0.5μm 粒子＞3500 个 / L），或过滤器使用超过 1 年→直接更换（联系厂家售后，避免自行拆卸导致密封失效）。
2、空白载体 / 耗材污染处理
● 一次性耗材：选择正规厂家，检查外包装是否破损、灭菌日期是否在有效期内；
● 自制培养基：灭菌后若需存放，需在 4℃冰箱密封保存，且不超过 7 天；使用前在 60℃水浴锅复温，避免冷凝水导致皿内污染；
● 无菌水 / 缓冲液：现配现用，若存放需密封并标注日期，超过 3 天直接丢弃。
3、操作 / 环境空气污染防控
规范操作流程：
● 放入 / 取出样品时，培养箱门打开时间≤20 秒，避免正对箱内呼气；
● 空白培养皿仅在超净台内打开，开盖后尽快密封（或倒入培养基后立即封口），手套每操作 1 小时更换 1 次，或用 75% 酒精擦拭消毒；
优化实验室环境：
● 培养箱所在房间保持洁净（定期拖地、紫外线消毒），避免与霉菌接种室、样品处理室同屋（减少空气杂菌浓度）；
● 若房间灰尘较多，可在培养箱旁放置空气净化器（HEPA 级），降低空气含菌量。
三、验证效果：空白培养验证试验
处理后需做 “空白对照验证”，确保污染已清除：
准备 3 组空白培养皿（每组 3 个）：
● 组 1：超净台内密封，不放入培养箱（验证耗材无菌性）；
● 组 2：超净台内密封后放入培养箱，同常规培养条件（30-35℃，湿度 70-85%）培养 72 小时；
● 组 3：超净台内开盖 10 秒后密封，放入培养箱培养（验证操作 + 环境污染）。
判定标准：3 组均无霉菌 / 杂菌生长→污染已解决；若组 2 / 组 3 仍长菌→需重新检查培养箱消毒或 HEPA 过滤器。
四、长期预防措施（避免复发）
定期维护培养箱（制定SOP）：
● 每周：更换加湿器无菌水，用75%酒精擦拭内胆+门封条；
● 每月：深度消毒1次（紫外线 + 酒精擦拭+霉菌专用杀菌剂），检查 HEPA 过滤器压差（压差过高→堵塞，需更换）；
● 每季度：联系厂家校准温度、湿度，检查箱内密封性能（门封条若老化、变形，及时更换）。
空白对照设置规范：
● 每次实验均设置 “耗材空白”（未接触培养箱）和 “培养箱空白”（接触培养箱），便于快速定位污染来源；
● 空白培养皿与样品皿分开摆放（避免样品皿交叉污染空白），最好分层放置（空白在上，样品在下）。
避免培养箱内过度潮湿：
● 培养过程中若皿内有大量冷凝水，可适当降低湿度（或在培养箱内放置干燥剂，定期更换），避免霉菌在冷凝水表面滋生；
● 样品皿若有培养基溢出，立即清理（用酒精擦拭污染区域，避免残留霉变）。
五、常见误区提醒
● 仅用紫外线消毒不够：紫外线无法穿透霉斑、培养基残留，需先物理清除污染物，再结合酒精/过氧化氢消毒/臭氧/霉菌专用杀菌剂；
● 加湿器加自来水：自来水含霉菌孢子、细菌，必须用无菌水或蒸馏水（每周更换，避免水箱成为 “污染源”）；
● 忽视搁板污染：搁板缝隙易残留培养基，需定期取出清洗灭菌（尤其是有样品溢出后）。
若按上述方法处理后，空白仍长菌，可能是培养箱内胆密封失效（如门封条破损、箱体漏气）或加热管 / 湿度传感器污染，建议联系厂家售后进行拆机深度清洁和维修。
本文由环凯转载自“实验室采购管家”公众号，版权归原作者所有，仅供学习参考，如有侵权请联系删除！
