微生物限度检查中沉降时间验证的探讨
发布时间：2026-03-09 浏览次数：55
一、前言
2025版中国药典9202 非无菌产品微生物限度检查指导原则中新增规定：当使用自然沉降法获得上清液作为供试品溶液时，需考察沉降时间对微生物回收的影响，必要时可在方法中明确自然沉降时间。
目前对于这块内容的资料比较少，可能会给实际检测中带来困扰。下面尝试对这块内容进行解读，希望有帮助。
二、涉及到的概念
这里涉及到两个方面的概念：一个是操作耐受性（Robustness），一个是保持时间研究（Hold Time Study）。
操作耐受性（Robustness）
在USP <1223>《替代微生物方法的验证》中给出的定义是：
A capacity of the method to remain unaffected by small but deliberate variations in method parameters, e.g., reagent volume, incubation time, or ambient temperature providing an indication of its reliability during normal usage.
该方法在方法参数发生微小但人为的变动时（例如试剂体积、孵育时间或环境温度）仍能保持稳定的能力，可反映其在常规使用中的可靠性。
USP <1223>《替代微生物方法的验证》：将耐用性（Robustness）列为验证参数之一。它要求你证明该方法在引入故意的、微小的、但合理的条件变化时（例如：分析人员不同、仪器型号微调、试剂品牌更换、分析时间的小幅波动等），其测定性能（如专属性、灵敏度、精密度）依然可靠，不受这些合理变动的影响。
保持时间研究（Hold Time Study）
EU GMP Guide Annex 15 Qualification and Validation：
Time limits for processing should be minimised and limits should be justified and appropriate to ensure product quality." "Where relevant, stability data to support the holding time should be provided.
加工时间限制应尽可能缩短，且限制措施需合理且适当，以确保产品质量。""在适用情况下，应提供支持储存时间的稳定性数据。
三、内容
1. 什么情况下需要做沉降时间验证？
如果出现了以下的一些情况时，则需要考虑做这个测试：
①样品颗粒较多
②膜过滤前需要沉降
③样品泡沫多
④高粘度样品
⑤静置时间超过1min
2. 如何做沉降时间验证？
2.1 供试品的选择
若产品没有抑菌性则直接用供试品来制备供试品溶液。
若产品有抑菌性则选择和供试品类似性质的产品（比如辅料）制备供试品溶液。
2.2 供试液制备
按照标准方法制备供试液（如1：10供试液）。
2.3 菌液制备
选择最有挑战性的菌株（通常选择黑曲霉来进行沉降测试）。将菌液制备成适宜浓度，确保加入后最终浓度在20-100 cfu/mL 以内。
2.4 加菌
在供试液中加入菌液（注意加菌量不超过供试液体积的1%），充分混匀。
T0组（对照组/0分钟）：不含供试品的稀释液，加菌混匀后，立即（通常在30秒-1分钟内）取样检测。可以采用薄膜过滤法或平皿法计数。
T1组（试验组/短时沉降/必须）：加菌混匀后，静置5分钟（根据验证时的时间来确定）。到达时间后，从液面中上层（模拟实际取样位置）吸取供试液，进行检测。
T2组（试验组/长时沉降/非必须）：加菌混匀后，静置15分钟（或更长，如0.5小时，作为最差条件）。到达时间后，同样从中上层取样检测。
2.5 注意事项
静置时间点的选择：应基于你实际操作中从供试液制备到完成取样所需的最长时间。如果实际最长等待10分钟，建议验证到20分钟以留出安全余量。
严禁再次振摇：在静置结束后取样时，绝对不能再次振摇混匀。因为验证的目的就是看在静置过程中，微生物是否随着颗粒物沉底导致上清液变少。如果再次振摇，会人为将沉下去的微生物重新悬浮，导致假阴性结果（掩盖沉降带来的损失）。
取样位置：应在供试液的中上层（通常液面下1-2cm处）吸取样品，模拟实际操作中为了避开沉渣而取上清液的动作。
3. 计算回收率
4. 可接受标准
4.1 回收率一般在50%-200%
T1（必须）和T2（供参考，不是必须）组的平均菌落数相对于T0组，回收率一般在50%-200%。证明在规定的沉降时间内，微生物均匀分布在供试液中或微生物未随沉降物脱离液相，沉降时间对回收率无显著影响。
4.2 回收率一般 < 50%
如果回收率一般 < 50%：证明微生物随着颗粒物沉淀，导致上清液中微生物数量减少，沉降时间有显著影响。此时，不能采用自然沉降后取上清液的方法。
4.3 关于黑曲霉和白色念珠菌的特殊说明
这里若是使用黑曲霉或白色念珠菌作为测试菌株，若沉降时间超过1分钟，则要考虑菌株本身比较重容易沉底，造成结果偏低的因素。
若出现这种情况可再额外设立一个对照组——连续混匀组：增设一个 T-Continuous组。该组在加菌后，在整个静置期间持续缓慢搅拌或每隔几分钟振摇一次，确保微生物始终不沉底。如果这一组的回收率接近100%，而T1/T2组回收率显著偏低，则更有力地证明：回收率下降主要是由于孢子本身的物理沉降，而非样品本身的抑菌性或其他因素。这可以区分是"沉降效应"还是"方法本身的缺陷"的问题。
如果上述做法优化后，回收率依然低于50%，则说明你的样品对黑曲霉孢子有强烈的吸附或抑制作用。可以采用一些其他的方法，例如：增加冲洗液体积，使用含表面活性剂（如吐温80）的冲洗液等来消除这种作用。
本文由环凯转载自“Micro视野”公众号，版权归原作者所有，仅供学习参考，如有侵权请联系删除！
