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食品微生物检验GB4789-30-2016 单核细胞增生李斯特氏菌检验检验及注意事项

发布时间:2021-08-15      浏览次数:3219    分享:

核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性


生物学特性:单核细胞增生李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,营养需求不高,兼性厌氧。该菌触酶阳性,有动力,具有溶血反应、能发酵葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖和七叶苷,不能发酵甘露醇和木糖,MR-VP阳性。

流行学特征:单核细胞增生李斯特菌是一种人畜共患病原菌,它的临床症状为菌血症、脑膜炎及导致孕妇流产。单核细胞增生李斯特菌广泛分布存在于自然界,可以加热杀死,但是对高浓度盐和酸相对不敏感。它还能在冰箱温度和真空包装内增殖,特别有风险的材料包括生或加工肉类、生牛奶产品、生或熏鱼、预制沙拉和长期真空储存的包装食物。

单核细胞增生李斯特氏菌的国标检验方法

操作注意事项

1:对易产生较大颗粒的样品(如肉类)进行检测时,建议使用带滤网均质袋,以便均质后用吸管吸取匀液;
2:预增菌时间与样品种类、目标菌和杂菌的含量及状态等因素有关。一般菌相比较复杂的高污染样品,如果增菌时间过长会导致杂菌生长过多,目标菌可能就会被另一种优势菌所取代,这种情况下,增菌时间不宜过长。低污染样品的增菌时间可以适当延长。由于本标准适用的样品种类众多,预增菌的时间应根据实际情况和经验进行具体选择。建议增菌液发生混浊时停止预增菌。
3:分离划线用直径3mm的接种环(1环约10微升)。
4:动力试验的培养温度不能超过30℃。

操作难点1-可疑菌落的识别

1)PALCAM培养基

可疑菌落特征:在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷。

疑点:单核细胞增生李斯特氏菌与属内其他李斯特氏菌菌落特征无明显差别,可疑菌落多,后续确证工作量大。

2)CRM014 李斯特氏菌显色培养基

可疑菌落特征:单核细胞增生李斯特氏菌形成蓝绿色规测光滑的小菌落,周围有乳白色脂肪沉淀环;其他李斯特氏菌为蓝绿色无晕圈菌落;杂菌被抑制或显示其他颜色。

疑点:乳白色脂肪沉淀环扩散覆盖其他菌落时极易引起假阳性。

操作难点一的解决方案:

1)CRM013 单增李斯特氏菌显色培养基

可疑菌落特征:单核细胞增生李斯特氏菌形成蓝绿色规测光滑的小菌落;其他李斯特氏菌为无色菌落;杂菌被抑制或显示其他颜色。

李斯特氏菌显色培养基与单增李斯特氏菌显色培养基的对比

CRM013 单增李斯特氏菌显色培养基的优势

配制简便:添加剂易溶,克服李斯特氏菌显色培养基配制不当所致晕圈特征不明显问题,同时节省了时间和减少了劳动强度。
特异性极强:对于阴性菌有着很好的抑制作用;对于有害李斯特菌和无害李斯特菌,有着很好的分辨能力和灵敏度;
结果易读:颜色清晰易辩,结果一目了然;
准确率高:能避免假阳性及假阴性结果。

操作难点二:可疑菌落鉴定

1)革兰氏染色镜检:李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌。

2)动力试验:李斯特氏菌有动力,在半固体或SIM培养基上方呈伞状生长,如伞状生长不明显,可继续培养5再观察结果

3)过氧化氢酶试验:李斯特氏菌过氧化氢酶阳性反应

4)传统生化试验:七叶苷、甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖磷酸盐胨水(MR/VP)

5)溶血试验:单增李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈;斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈;英诺克李斯特氏菌无溶血圈;伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域。若结果不明显,可置4℃冰箱24h~48h再观察。

注意事项:穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂,36 ℃±1 ℃培养24h~48h,于明亮处观察。

6)协同溶血试验cAMP(可选做项目)

实验操作:在血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌,挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,距离1~2mm,于36℃±1℃培养24h~48h。

结果判读:单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm 的β-溶血增强区域,斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域,伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm~10mm 的“箭头状”β-溶血增强区域,英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。若结果不明显,可置4 ℃冰箱24h~48h再观察。


操作难点二解决方案:

1)MID67李斯特氏菌鉴定系统

MID67 李斯特菌鉴定系统优点

MID67 中的溶血试验反应,可替代传统的血平板溶血试验和CAMP

MID67  李斯特菌鉴定系统使用流程

最后将数值编码输入MID数据库中检索,即可获得鉴定结果。

2)单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光PCR快检法

产品:单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光PCR扩增试剂盒

技术原理:基于实时荧光PCR技术,针对检测目标特异性基因片段设计引物和荧光探针并优化反应所需试剂组分,加入待检样品核酸即可进行扩增反应。在扩增过程中,荧光探针与目的基因片段结合,可被Taq酶分解并产生荧光信号,此时荧光定量PCR仪可识别该荧光信号,同时根据其强弱变化绘制出相应的实时扩增曲线,进而判定目标基因是否检出。

产品优势:快速提取,一步法核酸提取,快速高效,核酸提取效率高;  操作简单,提供PCR反应体系预混液,直接加样检测,无需自行配制;  特异性强,采用高特异性引物及探针,确保实验准确性;  灵敏度高,采用高效的扩增酶,检测灵敏度可达10-100copies/test。

产品组成:

组分名称

规格×数量
预混液1mL×1管
阳性对照200μL×1管
阴性对照200μL×1管
裂解液1mL×2管
说明书1份


质量控制及疑难解析

一,质量控制

1: 实验室过程中,每批预增菌液、选择性增菌液、分离平板等都要做空白对照。以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。
2: 定期使用单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19115菌种或等效的其他标准株,在P2实验室或阳性对照实验室内,用适当的食品样品进行阳性对照实验验证,污染剂量应控制在10-100CFU/25g,并进行记录,验证实验至少每2个月进行1次。
3:要求对使用的培养基和生化试剂每批均用GB4789.30-2016推荐的阳性和阴性对照标准菌种进行验证,并做好记录。


二,疑难解析

Q1: 为什么在没有典型菌落时仍要挑取非典型菌落进行鉴定?
根据经验,有少数单核细胞增生李斯特氏菌在李斯特显色平板上呈现非典型菌落。
Q2:为什么在PALCAM选择性平板上挑取典型菌落,鉴定后非单核细胞增生李斯特菌的概率较高?
PALCAM是李斯特菌属的选择性平板,根据经验,环境存在较多的英诺克李斯特菌,应结合显色平板,挑取较多的典型菌落鉴定。
Q3:当3个及以上连续稀释度的结果均为阳性时,如何选择?
选择原则参考Bacteriological Analytical Mannual Appendix 2: Most Probable Number form Serial Dilutions。
Q4:如果前增菌或选择性增菌结束后,肉汤中未见微生物生长,是否可以终止实验?

不可以,因为肉眼可见的细菌浓度为107CFU/mL,在此浓度以下,肉眼是不能发现。

所需培养基试剂


用途

货号

名称

规格

增菌液

026040

李氏增菌肉汤(LB1,LB2)基础

瓶(干粉)250g

SR0100

李氏增菌肉汤LB1配套试剂

10支/盒

SR0110

李氏增菌肉汤LB2配套试剂

10支/盒

CP0490
LB1增菌液
225ml × 6瓶
CP0500
李氏增菌肉汤LB2
10ml× 20支

分离平板

026070

PLACAM琼脂

瓶(干粉)250g

SR0140

PLACAM琼脂配套试剂

10支/盒

029980

PLACAM琼脂平板

盒(平板)90 mm×20

CRM014

李斯特氏菌显色培养基

1L用量(干粉)

CRM014P1

李斯特氏菌显色培养基平板

盒(平板)90 mm×20

CRM013

单增李斯特氏菌显色培养基

1L用量(干粉)

CRM013P1

单增李斯特氏菌显色培养基

盒(平板)90 mm×20

026020
胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)
瓶(干粉)250g

生化鉴定

HKI008

EasyID单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定试剂盒

10测试/盒

核酸快速检测试剂盒

FZ007BF2

单核细胞增生李斯特氏菌核酸快速检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

48测试/盒
鉴定系统 HK-MID-67

HK-MID李斯特菌鉴定系统

10测试/盒

纯培养 026020A

含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)平板

盒(平板)90 mm×20

溶血试验 024070 血平板

盒(平板)90 mm×20

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