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HKT001系列 Simple Cloning T-vector(pSC-T)

英文名称:Simple Cloning T-vector(pSC-T)

货 号 :HKT001系列

规 格 :20次 | 20次×5

用途:PCR 产物高效 TA 克隆的专用 T 载体

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产品名称:Simple Cloning T-vector(pSC-T)

产品编号与包装规格:

编号产品名称规格产品介绍价格
HKT001-01ASimple Cloning T-vector(pSC-T)20次T载体540
HKT001-01B20次×52398

产品描述:
      Simple Cloning T-vector(pSC-T)是一种 PCR 产物高效 TA 克隆的专用 T 载体,本载体消除了 PCR 产物插入区域两侧的 多克隆位点。
      在 PCR 克隆构建过程中,为了进一步的克隆步骤,常会 在PCR 产物的两端引入专门的酶切位点,如 T 载体上已带有 相同的酶切位点,会对下一步的酶切连接带来不利的影响。为 消 除 多 克 隆 酶 切 位 点 带 来 的 负 作 用 , Simple Cloning T- Vector去除了PCR 产物插入区域两侧所有的酶切位点。带有酶 切位点的 PCR 产物克隆后进行酶切时,T 载体上不会有相同 的酶切位点影响酶切反应,可以大大提高酶切效率,增加亚 克隆成功率。多克隆位点的消除并不影响 β-半乳糖苷酶的正 常表达,PCR 产物克隆后仍可以利用 α-互补性进行蓝白斑筛 选,挑选阳性克隆。
      由于本载体上消除了多克隆酶切位点,在 PCR 扩增引物设 计时需要考虑导入合适的酶切位点。

产品特点:提供 2×快速连接系统(15 分钟即可完成连接反应)及 10×传统 型连接系统(过夜连接可获得最佳连接效果),具体使用说明见 后。

使用建议:
      1)连接使用的 PCR 片段3' 端应带有 A 末端,如果是使用 pfu 等高保真聚合酶扩增的不带 A 末端的平末端片段,不可直 接用于进行连接反应。
      2)克隆时使用的 Insert DNA 片段(PCR 产物)建议进行 切胶回收纯化,否则 PCR 产物中的短片段 DNA、残留引物等 杂质都会影响 TA 克隆效率。
      3)转化过程中建议使用 Control Insert DNA 做对照,以便 在实验出现问题时确定原因。

保存温度:-20℃

Simple Cloning T-vector(pSC-T) 产品包装(A包装):

Simple Cloning T-vector(pSC-T) 产品包装(A包装)

质量保证:
   Control Insert 克隆后的白色菌落中,有90%以上含 有Insert DNA 片段。
   克隆后,经测序确认''T''突出的存在。

操作方法:
      1) 选择合适的连接体系(详细介绍见背面)。
      2) 取10μL 加入至 100μL 感受态细胞中,用移液 枪吹打混合,冰上放置30 分钟。
      3) 将离心管置于 42℃水浴中,热击 60-90 秒,迅 速将离心管置于冰上,放置 2-3 分钟。
      4) 向每个离心管中加入 500μL 无菌不含抗生素的 LB 或SOC 培养基中,37℃摇床,150rpm 振荡培养 45 分钟,使质粒上氨苄抗性基因表达,菌体复苏。
      5) 吸取200μL 已转化的感受态细胞,加到含氨苄 青霉素的 LB 或SOC 固体平板上,用无菌涂布棒将细 胞均匀涂开,将平板置于 37℃培养箱里直至液体完全 吸收,倒置培养 12-16 小时。
      6) PCR检测,利用试剂盒自带的高速PCR扩增试 剂2×FastTaq Mast Mix直接进行菌落PCR鉴定。

A、常规连接反应体系(20μL)

组分体积
10×Ligation Buffer2μL
pSC-Tvector(25 ng/μL)2μL
目的PCR 片段/ Control Insert DNAX μL/1 μL
T4 DNA Ligase1μL
ddH2O至 20μL

反应条件: 
1)16℃保温 3 小时以上或过夜。 
2)在4℃保温过夜,或室温数小时,但反应效率较16℃过夜略低。 实践表明连接反应的温度越低,达到理想连接效率所需时间越长,温度 较高则所需时间较短。 

注:10×Ligation Buffer融化时,如果出现少量沉淀属正常现象,请于37℃ 溶解混匀后使用。

B、 快速连接反应体系:

组分体积
2×Quick Ligation Buffer10μL
pSC-Tvector(25 ng/μL)2μL
目的PCR 片段/ Control Insert DNAX μL/1 μL
T4 DNA Ligase1μL
ddH2O至 20μL

反应条件:
1)16℃ 或 25℃下,保温15至30分钟。
2)保温5分钟也能正常进行反应,但反应效率略为 降低。25℃下进行连接,其效果略差于16℃下连接效果。 而更高的温度(>26℃)则较难形成环状DNA。连接效率 偏低时,可适当延长连接反应时间,但过长的连接时间 (如数小时)连接效果反而会变差。一些较难连接的片 段(如大片段),请采用传统型10× T4 DNA Ligation Buffer体系进行尝试。

pSC-T 结构图