English

国内外药典中黄曲霉毒素的测定方法

发布时间:2022-10-21      浏览次数:2995    分享:

黄曲霉毒素具有较强的毒害作用,可诱发肝、肾、肺、胃等部位的癌变,黄曲霉毒素B1被公认为是目前致癌力最强的天然物质。

黄曲霉毒素

药材、饮片及制剂在贮藏、制备、运输过程中,如保存不当,就会有受潮霉变而污染黄曲霉毒素的可能。

因此,各药典都将黄曲霉毒素列为很重要的安全性指标,中国药典和欧洲药典对多种中药材都都建立了黄曲霉素检查指标,美国药典对植源性的药品也要求检查黄曲霉毒素。

今天小编就详细介绍中国药典、欧洲药典和美国药典的黄曲霉毒素测定方法,总结出各药典的差异,并列出详细的检验方法,供各位参考。

1、比较中国药典、美国药典、欧洲药典的检查方法

各药典中方法号、限度、适用范围等列表如下,由此可见,各药典收载的检测方法不同、限度不同,最严格的当属欧洲药典。

对比内容中国药典美国药典欧洲药典
依据 通则2351真菌毒素测定法GENERAL CHAPTERS<561>2.8.18 DETERMINATION OF AFLATOXIN B1 IN HERBAL DRUGS
方法

HPLC法TLC法HPLC法


HPLC-MS法薄层扫描法


酶联免疫法HPLC法
限度 每1000g含黄曲霉毒素B1不得过5µg ,总量不得过 10µg。每1000g含黄曲霉毒素B1不得过5µg,总量不得过 20µg。每1000g含黄曲霉毒素B1不得过2µg,总量不得过4µg。
说明 中国药典的三种方法都可以使用,当测定结果超出限度时,采用第二法进行确认。首先使用第一法,第一法系统适用性不通过才会使用第二法或第三法。只有一种方法,适用于devil' s claw root, ginger and senna pods,用于其他品种需要验证适用性。

注:总量为黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)和黄曲霉毒素G2(AFG2)的总量。

2、详解中国药典、美国药典、欧洲药典的HPLC方法

黄曲霉毒素检查方法中,唯一同时适用于三家药典的方法,只有HPLC法(荧光检测器),而且光化学检测器与HPLC-荧光检测器配套使用,在线对黄曲霉毒素B1、G1进行衍生,不需要任何化学试剂,应用范围较广,因此本文重点比较此法在各药典中的异同。

从以下几部分可以看出,色谱柱、流动相、流速、波长、供试品和对照品的配制方法、进样量等内容都存在较大差异,需要谨慎对照使用。

本文详细写出了USP中的几种测定方法。

2.1 中国药典中黄曲霉毒素检查方法(HPLC法)

检验方法具体内容
色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
流动相甲醇-乙腈-水(40 : 18 : 42)
流速1.0mL/min
柱后衍生化光化学衍生器(254nm)
检测器荧光检测器,激发波长360nm (或365nm),发射波长450nm。
系统适用性两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5;需确认回收率应在60~120%,线性回归的相关系数应不低于0.990;
混合对照品溶液精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液(黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 标示浓度分别为 1.0µ/mL、0. 3µg/mL、1.0µg/mL、0.3µg/mL)0.5mL,置10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,作为贮备溶液。精密量取贮备溶液1mL,置25mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,即得。
供试品溶液取供试品粉末约15g(过二号筛),精密称定,置于均质瓶中,加入氯化钠3g,精密加入70%甲醇溶液75mL, 高速搅拌2 分钟(搅拌速度大于11000 r/min),离心 5 分钟(离心速度4000r/min),精密量取上清液15mL, 置50mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,离心 10分钟(离心速度4000r/min),精密量取上清液20mL,通过免疫亲合柱,流速每分钟3mL, 用水20mL洗脱(必要时可以先用淋洗缓冲液10mL洗脱,再用水10mLl洗脱),弃去洗脱液,使空气进人柱子,将水挤出柱子,再用适量甲醇洗脱, 收集洗脱液,置 2mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0. 22µm)滤过,取续滤液,即得。
进样量混合对照品溶液5µl、10µl、15µl、20µl、25µl;供试品溶液20~50µl。
定量方法测定各对照品溶液的峰面积,以峰面积为纵坐标,以进样量为横坐标,绘制标准曲线;测定供试品溶液的峰面积,从标准曲线上读出供试品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量,并计算出四者总和。

2.2 美国药典中黄曲霉毒素检查方法(HPLC法)

检验方法具体内容
色谱柱4.6-mm×15 cm,3-µm填料L1(即十八烷基硅烷键合硅胶)
流动相水-甲醇-乙腈(60:25:15)
流速0.8 mL/min
柱后衍生化光化学衍生器(254nm)
检测器荧光检测器,激发波长362nm,发射波长440nm
系统适用性洗脱顺序为AFG2、AFG1、AFB2和AFB1;
将5号线性对照溶液5mL加入到5g的样品中,按“供试品溶液”(甲醇-0.5%碳酸氢钠(7:3)用量为20mL)处理方法,计算AFB1(2µg/kg)和黄曲霉毒素(5µg/kg)的平均回收率,应分别不低于68%和70%。AFB1和黄曲霉毒素总量的相对标准偏差(RSD)不高于10%。
免疫亲和柱预处理免疫黄曲霉素柱的总黄曲霉毒素最小容量不低于100ng。将AFB1、AFB2、AFG1和AFG2每个5ng,溶于10mL 10%甲醇的磷酸盐缓冲盐溶液(v/v)中时,各回收率不低于80%。
对照品溶液用乙腈制备AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别含有2.0、0.50、2.0和0.50µg/mL的混合对照溶液。首先用乙腈制备标示浓度均为10µg/mL的各储备液,在360nm附近测定最大吸光度,计算公式为:黄曲霉毒素浓度(µg/mL)=(A×Mr×1000)/ε,其中A为吸光度,Mr为分子量,ε为摩尔吸收系数,见附表1。准确量取一定量黄曲霉毒素各储备液至同一容量瓶,用乙腈稀释至规定浓度。冰箱储存,使用前平衡至室温。用甲醇 - 水(1:1)稀释黄曲霉素对照溶液,最终浓度见附表2。冰箱保存,使用前平衡至室温,每日新制。
供试品溶液取样品5g,置于50mL离心管中,加入氯化钠1 g和甲醇 - 0.5%碳酸氢钠(7:3)25 mL。在涡流混合器上混合,直到样品颗粒和提取溶剂充分混合,400 rpm振摇10min,7000 rpm离心10min,立即取7 mL至50 mL离心管中,加入0.1 M磷酸盐缓冲溶液28 mL,混合,过滤,收集25mL滤液(相当于1g样品)到25mL刻度量筒中,并立即上IAC柱。[注:对于IAC柱在使用前必须在室温下至少平衡15分钟。]从小柱上取下顶盖,并将其与储液罐连接。从柱上拆下端盖,并将其连接到柱歧管上(必须拧紧)。让柱中的液体通过,直到液体高出柱床约2~3 mm。将滤液25mL倒入储液罐。让液体自然流过柱子,让柱子流干。为了便于再次开始流动,从歧管上取下色谱柱,向柱中加入磷酸盐缓冲盐溶液约2 mL,将色谱柱重新连接到储液罐上,然后用磷酸盐缓冲盐溶液3mL和水5mL清洗色谱柱(如果使用其他技术去除柱末端的气泡并很容易重新开始流动,则可将磷酸盐缓冲盐溶液5mL直接加入到柱储液罐中)。让柱子流干,然后用注射器注入3mL空气通过柱子,用甲醇1mL洗脱,并用3mL容量瓶中收集洗脱液,使洗脱液自由滴落。让柱子流干。静置1分钟,然后用额外的甲醇1mL洗脱,并收集在同一容量瓶中。让柱子流干,并注入10mL空气通过柱子,用水稀释洗脱液至刻度,立即进行分析。
进样量50µl
定量方法毒素(µg/kg)={[(R−a)/S]×V/W}×F
R=样品溶液的峰面积;a=校准曲线的y截距;S=校准曲线的斜率;V=样品溶液的最终体积(mL);W=通过免疫柱的供试品1g;F=稀释系数,V=3 mL时为1;黄曲霉毒素的总量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的总和。

2.3 欧洲药典中黄曲霉毒素检查方法(HPLC法)

检验方法具体内容
色谱柱柱长0.25m,直径4.6mm,十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(5-µm)
流动相乙腈-甲醇-水(2:3:6)
流速1.0mL/min
柱后衍生化光化学衍生器(254nm)
检测器荧光检测器检测,激发波长= 365nm,发射波长Aem =435nm。
系统适用性出峰顺序:G2、G1、B2、B1;需满足验证要求。
对照品溶液用甲苯-乙腈(98:2)制备10µg/mL AFB1贮备溶液,并在330nm~370nm波长范围内测定吸收曲线,计算公式为:黄曲霉毒素浓度(µg/mL)=(A×M×100)/ε,其中A为紫外吸收曲线上的最大吸光度,M为B1的分子量(312g/mol),ε为摩尔吸收系数(1930m2/mol)。用甲苯-乙腈(98:2)将初级贮备液稀释为100ng/mL的次级贮备液,用铝箔紧密包好后,置于4℃储存,使用前,待溶液恢复至室温后才能取下铝箔。使用前后记录容量瓶的重量。按附表3制备系列对照溶液,将所需体积的次级贮备液置于250mL容量瓶中,氮气吹干,加入甲醇75mL溶解黄曲霉毒素B1,并用水稀释至刻度。
免疫亲和柱预处理免疫亲和柱对黄曲霉毒素B1的容量不低于100 ng。将AFB1 5 ng,溶于12.5mL甲醇和87.5 mL 水中时,回收率不低于80%。使用前平衡至室温。
供试品溶液取本品粉末5.00g,加入甲醇:水(70:30)混合溶液100mL,超声处理30min,取滤液10mL至150mL锥形瓶,并加入水70mL。取40mL以流速3mL/min(不得超过5mL/min)通过免疫亲和柱。用水以流速5mL/min冲洗小柱两次,每次10mL. 用注射器注入空气10s。取甲醇5mL注入小柱,并保持自然流出,收集洗脱液至5mL容量瓶中,1min后,注入甲醇0.5mL ,再隔1min后,注入甲醇0.5mL,每次加入甲醇后,均通过注入空气收集洗脱液,用水稀释至容量瓶刻度,摇匀。溶液澄清的话,可直接用于分析;否则应过滤处理,并确保黄曲霉毒素没有损失。
进样量500µl
定量方法用黄曲霉毒素B1系列对照溶液1~5做标准曲线,样品浓度超出线性范围,则需要做相应稀释。
毒素(µg/kg)=[(R−b)/a]×V /W
R=样品溶液的峰面积;b=校准曲线的截距;a=校准曲线的斜率;V稀释倍数;W=通过免疫柱的供试品g;黄曲霉毒素的总量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的总和。

2.4 上述方法中的三个附表

附表1
黄曲霉毒素M溶剂ε
AFB1312乙腈20700
AFB2314乙腈22500
AFG1328乙腈17600
AFG233乙腈18900

附表2
序号黄曲霉素对照溶液加入量(µl)黄曲霉素工作对照溶液(ng/ml)
AFB1AFB2AFG1AFG2总和
1000000
212.50.250.06250.250.06250.625
3250.50.1250.50.1251.25
45010.2510.252.5
510020.520.55
6200414110

附表3
系列对照溶液加入次级贮备液的体积(µl)对照溶液的最终浓度(ng/ml)
11250.05
22500.1
35000.2
47500.3
510000.4

3、注意事项

由于黄曲霉毒素的毒性,实验过程必须小心谨慎,小编总结出4条注意事项,供大家参考:
1、使用真菌毒素对照品,必须穿好防护服,带好手套,在通风橱内进行,并将工作台盖上胶布。非实验人员未经允许,不得进入实验室,以免发生意外。
2、黄曲霉毒素容易光降解,实验过程需要避光,对照品和供试品溶液也需要避光保存,线性对照溶液需要临用现配。
3、真菌毒素为痕量分析,易受环境污染,应随行进行空白试验与加样回收率实验。
4、用过的玻璃仪器需用次氯酸钠溶液浸泡2小时。

来源:环凯转载于食品微生物检测公众号
说明:文章、视频、图片等所有内容,仅用于学习交流,若有侵权内容及其他涉法内容,请及时联系删除或修改,特此声明!


相关产品

//