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国内外药典中黄曲霉毒素的测定方法
发布时间：2022-10-21 浏览次数：3326 分享：
黄曲霉毒素具有较强的毒害作用，可诱发肝、肾、肺、胃等部位的癌变，黄曲霉毒素B1被公认为是目前致癌力最强的天然物质。
药材、饮片及制剂在贮藏、制备、运输过程中，如保存不当，就会有受潮霉变而污染黄曲霉毒素的可能。
因此，各药典都将黄曲霉毒素列为很重要的安全性指标，中国药典和欧洲药典对多种中药材都都建立了黄曲霉素检查指标，美国药典对植源性的药品也要求检查黄曲霉毒素。
今天小编就详细介绍中国药典、欧洲药典和美国药典的黄曲霉毒素测定方法，总结出各药典的差异，并列出详细的检验方法，供各位参考。
1、比较中国药典、美国药典、欧洲药典的检查方法
各药典中方法号、限度、适用范围等列表如下，由此可见，各药典收载的检测方法不同、限度不同，最严格的当属欧洲药典。
| 对比内容 | 中国药典 | 美国药典 | 欧洲药典 | |
|---|---|---|---|---|
| 依据 | 通则2351真菌毒素测定法 | GENERAL CHAPTERS<561> | 2.8.18 DETERMINATION OF AFLATOXIN B1 IN HERBAL DRUGS | |
| 方法 | 第 一 法 | HPLC法 | TLC法 | HPLC法 |
| 第 二 法 | HPLC-MS法 | 薄层扫描法 | ||
| 第 三 法 | 酶联免疫法 | HPLC法 | ||
| 限度 | 每1000g含黄曲霉毒素B1不得过5µg ，总量不得过 10µg。 | 每1000g含黄曲霉毒素B1不得过5µg，总量不得过 20µg。 | 每1000g含黄曲霉毒素B1不得过2µg，总量不得过4µg。 | |
| 说明 | 中国药典的三种方法都可以使用，当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认。 | 首先使用第一法，第一法系统适用性不通过才会使用第二法或第三法。 | 只有一种方法，适用于devil' s claw root, ginger and senna pods，用于其他品种需要验证适用性。 | |
注：总量为黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）和黄曲霉毒素G2（AFG2）的总量。
2、详解中国药典、美国药典、欧洲药典的HPLC方法
黄曲霉毒素检查方法中，唯一同时适用于三家药典的方法，只有HPLC法（荧光检测器），而且光化学检测器与HPLC-荧光检测器配套使用，在线对黄曲霉毒素B1、G1进行衍生，不需要任何化学试剂，应用范围较广，因此本文重点比较此法在各药典中的异同。
从以下几部分可以看出，色谱柱、流动相、流速、波长、供试品和对照品的配制方法、进样量等内容都存在较大差异，需要谨慎对照使用。
本文详细写出了USP中的几种测定方法。
2.1 中国药典中黄曲霉毒素检查方法（HPLC法）
| 检验方法 | 具体内容 |
|---|---|
| 色谱柱 | 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 |
| 流动相 | 甲醇-乙腈-水(40 : 18 : 42) |
| 流速 | 1.0mL/min |
| 柱后衍生化 | 光化学衍生器（254nm） |
| 检测器 | 荧光检测器，激发波长360nm (或365nm)，发射波长450nm。 |
| 系统适用性 | 两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5；需确认回收率应在60~120%，线性回归的相关系数应不低于0.990； |
| 混合对照品溶液 | 精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 标示浓度分别为 1.0µ/mL、0. 3µg/mL、1.0µg/mL、0.3µg/mL）0.5mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液1mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。 |
| 供试品溶液 | 取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75mL, 高速搅拌2 分钟（搅拌速度大于11000 r/min），离心 5 分钟（离心速度4000r/min），精密量取上清液15mL, 置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心 10分钟（离心速度4000r/min)，精密量取上清液20mL，通过免疫亲合柱，流速每分钟3mL, 用水20mL洗脱(必要时可以先用淋洗缓冲液10mL洗脱，再用水10mLl洗脱），弃去洗脱液，使空气进人柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱, 收集洗脱液，置 2mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0. 22µm)滤过，取续滤液，即得。 |
| 进样量 | 混合对照品溶液5µl、10µl、15µl、20µl、25µl；供试品溶液20~50µl。 |
| 定量方法 | 测定各对照品溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，绘制标准曲线；测定供试品溶液的峰面积，从标准曲线上读出供试品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，并计算出四者总和。 |
2.2 美国药典中黄曲霉毒素检查方法（HPLC法）
| 检验方法 | 具体内容 |
|---|---|
| 色谱柱 | 4.6-mm×15 cm，3-µm填料L1（即十八烷基硅烷键合硅胶） |
| 流动相 | 水-甲醇-乙腈（60:25:15） |
| 流速 | 0.8 mL/min |
| 柱后衍生化 | 光化学衍生器（254nm） |
| 检测器 | 荧光检测器，激发波长362nm，发射波长440nm |
| 系统适用性 | 洗脱顺序为AFG2、AFG1、AFB2和AFB1； 将5号线性对照溶液5mL加入到5g的样品中，按“供试品溶液”（甲醇-0.5%碳酸氢钠（7:3）用量为20mL）处理方法，计算AFB1（2µg/kg）和黄曲霉毒素（5µg/kg）的平均回收率，应分别不低于68%和70%。AFB1和黄曲霉毒素总量的相对标准偏差（RSD）不高于10%。 |
| 免疫亲和柱预处理 | 免疫黄曲霉素柱的总黄曲霉毒素最小容量不低于100ng。将AFB1、AFB2、AFG1和AFG2每个5ng，溶于10mL 10%甲醇的磷酸盐缓冲盐溶液（v/v）中时，各回收率不低于80%。 |
| 对照品溶液 | 用乙腈制备AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别含有2.0、0.50、2.0和0.50µg/mL的混合对照溶液。首先用乙腈制备标示浓度均为10µg/mL的各储备液，在360nm附近测定最大吸光度，计算公式为：黄曲霉毒素浓度（µg/mL）=（A×Mr×1000）/ε，其中A为吸光度，Mr为分子量，ε为摩尔吸收系数，见附表1。准确量取一定量黄曲霉毒素各储备液至同一容量瓶，用乙腈稀释至规定浓度。冰箱储存，使用前平衡至室温。用甲醇 - 水（1:1）稀释黄曲霉素对照溶液，最终浓度见附表2。冰箱保存，使用前平衡至室温，每日新制。 |
| 供试品溶液 | 取样品5g，置于50mL离心管中，加入氯化钠1 g和甲醇 - 0.5%碳酸氢钠（7:3）25 mL。在涡流混合器上混合，直到样品颗粒和提取溶剂充分混合，400 rpm振摇10min，7000 rpm离心10min，立即取7 mL至50 mL离心管中，加入0.1 M磷酸盐缓冲溶液28 mL，混合，过滤，收集25mL滤液（相当于1g样品）到25mL刻度量筒中，并立即上IAC柱。[注：对于IAC柱在使用前必须在室温下至少平衡15分钟。]从小柱上取下顶盖，并将其与储液罐连接。从柱上拆下端盖，并将其连接到柱歧管上（必须拧紧）。让柱中的液体通过，直到液体高出柱床约2~3 mm。将滤液25mL倒入储液罐。让液体自然流过柱子，让柱子流干。为了便于再次开始流动，从歧管上取下色谱柱，向柱中加入磷酸盐缓冲盐溶液约2 mL，将色谱柱重新连接到储液罐上，然后用磷酸盐缓冲盐溶液3mL和水5mL清洗色谱柱（如果使用其他技术去除柱末端的气泡并很容易重新开始流动，则可将磷酸盐缓冲盐溶液5mL直接加入到柱储液罐中）。让柱子流干，然后用注射器注入3mL空气通过柱子，用甲醇1mL洗脱，并用3mL容量瓶中收集洗脱液，使洗脱液自由滴落。让柱子流干。静置1分钟，然后用额外的甲醇1mL洗脱，并收集在同一容量瓶中。让柱子流干，并注入10mL空气通过柱子，用水稀释洗脱液至刻度，立即进行分析。 |
| 进样量 | 50µl |
| 定量方法 | 毒素（µg/kg）={[（R−a）/S]×V/W}×F R=样品溶液的峰面积；a=校准曲线的y截距；S=校准曲线的斜率；V=样品溶液的最终体积（mL）；W=通过免疫柱的供试品1g；F=稀释系数，V=3 mL时为1；黄曲霉毒素的总量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的总和。 |
2.3 欧洲药典中黄曲霉毒素检查方法（HPLC法）
| 检验方法 | 具体内容 |
|---|---|
| 色谱柱 | 柱长0.25m，直径4.6mm，十八烷基硅烷键合硅胶为固定相（5-µm） |
| 流动相 | 乙腈-甲醇-水(2:3:6) |
| 流速 | 1.0mL/min |
| 柱后衍生化 | 光化学衍生器（254nm） |
| 检测器 | 荧光检测器检测，激发波长= 365nm，发射波长Aem =435nm。 |
| 系统适用性 | 出峰顺序：G2、G1、B2、B1；需满足验证要求。 |
| 对照品溶液 | 用甲苯-乙腈(98:2)制备10µg/mL AFB1贮备溶液，并在330nm~370nm波长范围内测定吸收曲线，计算公式为：黄曲霉毒素浓度（µg/mL）=（A×M×100）/ε，其中A为紫外吸收曲线上的最大吸光度，M为B1的分子量（312g/mol），ε为摩尔吸收系数（1930m2/mol）。用甲苯-乙腈(98:2)将初级贮备液稀释为100ng/mL的次级贮备液，用铝箔紧密包好后，置于4℃储存，使用前，待溶液恢复至室温后才能取下铝箔。使用前后记录容量瓶的重量。按附表3制备系列对照溶液，将所需体积的次级贮备液置于250mL容量瓶中，氮气吹干，加入甲醇75mL溶解黄曲霉毒素B1，并用水稀释至刻度。 |
| 免疫亲和柱预处理 | 免疫亲和柱对黄曲霉毒素B1的容量不低于100 ng。将AFB1 5 ng，溶于12.5mL甲醇和87.5 mL 水中时，回收率不低于80%。使用前平衡至室温。 |
| 供试品溶液 | 取本品粉末5.00g，加入甲醇:水(70:30)混合溶液100mL，超声处理30min，取滤液10mL至150mL锥形瓶，并加入水70mL。取40mL以流速3mL/min（不得超过5mL/min）通过免疫亲和柱。用水以流速5mL/min冲洗小柱两次，每次10mL. 用注射器注入空气10s。取甲醇5mL注入小柱，并保持自然流出，收集洗脱液至5mL容量瓶中，1min后，注入甲醇0.5mL ，再隔1min后，注入甲醇0.5mL，每次加入甲醇后，均通过注入空气收集洗脱液，用水稀释至容量瓶刻度，摇匀。溶液澄清的话，可直接用于分析；否则应过滤处理，并确保黄曲霉毒素没有损失。 |
| 进样量 | 500µl |
| 定量方法 | 用黄曲霉毒素B1系列对照溶液1~5做标准曲线，样品浓度超出线性范围，则需要做相应稀释。 毒素（µg/kg）=[（R−b）/a]×V /W R=样品溶液的峰面积；b=校准曲线的截距；a=校准曲线的斜率；V稀释倍数；W=通过免疫柱的供试品g；黄曲霉毒素的总量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的总和。 |
2.4 上述方法中的三个附表
| 附表1 | |||
|---|---|---|---|
| 黄曲霉毒素 | M | 溶剂 | ε |
| AFB1 | 312 | 乙腈 | 20700 |
| AFB2 | 314 | 乙腈 | 22500 |
| AFG1 | 328 | 乙腈 | 17600 |
| AFG2 | 33 | 乙腈 | 18900 |
| 附表2 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 序号 | 黄曲霉素对照溶液加入量(µl) | 黄曲霉素工作对照溶液（ng/ml） | ||||
| AFB1 | AFB2 | AFG1 | AFG2 | 总和 | ||
| 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 12.5 | 0.25 | 0.0625 | 0.25 | 0.0625 | 0.625 |
| 3 | 25 | 0.5 | 0.125 | 0.5 | 0.125 | 1.25 |
| 4 | 50 | 1 | 0.25 | 1 | 0.25 | 2.5 |
| 5 | 100 | 2 | 0.5 | 2 | 0.5 | 5 |
| 6 | 200 | 4 | 1 | 4 | 1 | 10 |
| 附表3 | ||
|---|---|---|
| 系列对照溶液 | 加入次级贮备液的体积(µl) | 对照溶液的最终浓度(ng/ml) |
| 1 | 125 | 0.05 |
| 2 | 250 | 0.1 |
| 3 | 500 | 0.2 |
| 4 | 750 | 0.3 |
| 5 | 1000 | 0.4 |
3、注意事项
由于黄曲霉毒素的毒性，实验过程必须小心谨慎，小编总结出4条注意事项，供大家参考：
1、使用真菌毒素对照品，必须穿好防护服，带好手套，在通风橱内进行，并将工作台盖上胶布。非实验人员未经允许，不得进入实验室，以免发生意外。
2、黄曲霉毒素容易光降解，实验过程需要避光，对照品和供试品溶液也需要避光保存，线性对照溶液需要临用现配。
3、真菌毒素为痕量分析，易受环境污染，应随行进行空白试验与加样回收率实验。
4、用过的玻璃仪器需用次氯酸钠溶液浸泡2小时。
来源：环凯转载于食品微生物检测公众号
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