一文带您看懂革兰氏染色
发布时间：2023-06-20 浏览次数：6632
1884年丹麦学者革兰（C.Gram）根据细菌细胞壁构造和化学成分的特点，通过染色表现出脱色能力的不同，将细菌分为革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌两大类，创立了革兰氏染色法，迄今仍是细菌学中极其重要的一种鉴别染色法。
革兰氏染色方法：一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。
具体操作：
1、将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液。染1min，水洗。
2、滴加碘液，作用1min。水洗。
3、滴加脱色酒精，约30s；或将脱色酒精滴满整个涂片，立即倾去，再用95%酒精滴满整个涂片，脱色10s。
4、水洗，滴加沙黄复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。
革兰氏染色的结果解析
革兰氏染色的结果：革兰氏阳性呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色（图1）。
图1 革兰氏染色结果（左：革兰氏阳性，右：革兰氏阴性）
为什么会是这样的结果？
这与细菌细胞壁结构密切相关。革兰氏阳性菌细胞壁含有较厚的肽聚糖层，交联度高，不含类脂层；而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，交联度低，且类脂层（脂多糖、磷脂、脂蛋白）含量高。（图2）
图2 革兰氏阳性菌与阴性细菌细胞壁的比较
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，而G+和G-细菌的细胞壁结构对结晶紫-碘复合物的物理阻留能力不同。乙醇脱色处理后，G+细菌细胞壁肽聚糖网孔收缩，将结晶紫-碘复合物阻留在细胞内，经革兰氏染色显示蓝紫色。而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇乙醇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄复染，就显示红色。
操作细节说明：
1、控制好每一阶段的染色时间和脱色时间，染色时间过长或脱色时间过短可能导致假阳性，染色时间短或脱色长可能导致假阴性。
2、选择处于对数生长期的菌，此时菌最为活跃，活力较强，（一般培养至18-24h的菌）。若培养时间过久，菌已经老化，处于衰亡期，细菌细胞壁通透性增加，容易将原本G+细菌染成了G-菌。
3、制片不可过厚，挑取少量菌苔研磨成一薄膜固定。若菌苔过厚，菌体层层堆叠、毫无缝隙，加之细胞壁成分影响脱色效果，会产生假阳性的结果，同时镜检视野中菌体连片，分辨不出其菌体细胞形态，影响观察。
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