hPSCs细胞来源的肠类器官培养方案
发布时间：2023-07-21 浏览次数：371
肠上皮是成年哺乳动物中自我更新最快的组织，平均自我更新时间少于5天。肠干细胞位于肠隐窝（intestinal crypt）底部附近，每个隐窝中的干细胞大约有4-6个，它们产生快速增殖的转运扩增(TA)细胞，肠细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞都从TA细胞发育而来。TA细胞快速分裂、转运扩增的子细胞占据了隐窝的其余部分，并流向绒毛的侧面，在那里它们分化、吸收营养，最终在绒毛尖端凋亡【1】。
在体外可以由hPSCs来模拟胚胎肠发育的过程，通过添加高浓度的FGF4和Wnt3A，促使hPSCs衍生的终内胚层(DE)向中肠和后肠内胚层分化，并促进肠管样形态发生，进而产生包含吸收性肠细胞以及主要分泌谱系(包括Paneth细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞)的肠类器官。本篇文章基于Nature protocols【2】整理了hPSCs细胞来源的肠类器官培养方案。
细胞来源：hPSCs
培养基配方
hPSCs培养和传代
1，将冻存的Matrigel在4°C下过夜解冻，在6孔板的每孔滴加1ml冷的Matrigel，旋动6孔板使Matrigel溶液分布均匀。随后转移至37℃条件下孵育10min使其凝固，使用前需室温静置1h。
2，将hPSCs接种在包被Matrigel的6孔板中，每孔加入3ml mTeSR1，放置在37℃，5%CO2的培养箱中，培养至细胞融合度约为75–85%、且大部分无分化的状态时，吸出培养基。
3，向hPSCs中加入1 ml Dispase（1mg/ml），并将培养皿放置在37℃条件下进行解离，直到所有的细胞都以小细胞块或单细胞的形式漂浮。向每个孔中加入5ml的DMEM-F12，以充分稀释Dispase。
4，将所有细胞转移至离心管中，室温下300g离心3min，收集沉淀细胞。加入DMEM-F12培养基，以1:6的比例接种在Matrigel包被的24孔培养板中，向每个孔中加入0.5ml预热的mTeSR1进行培养，在2-4天内细胞汇合度达到85-90%。
hPSCs分化成DE
5，吸出mTeSR1，向每个孔中加入0.5 ml预热的第1天内胚层分化培养基，并将平板放回37℃，5%CO2的培养箱中。
6，24h后，吸出第1天内胚层分化培养基，替换为每孔0.5ml预热的第2天内胚层分化培养基，并将平板放回37℃，5%CO2的培养箱中。
7，24h后，吸出第2天内胚层分化培养基，替换为每孔0.5ml预热的第3天内胚层分化培养基，并将平板放回37℃，5%CO2的培养箱中。
8，24h后，吸出第3天内胚层分化培养基，用不含Activin A的第3天内胚层分化培养基洗涤细胞一次。此时在显微镜下观察细胞，应该存在扁平的DE组织，该组织包含非常少的3D结构。
DE分化为中肠和后肠
9，从24孔培养板中吸出培养基，每孔滴加0.5 ml预热的中肠和后肠分化培养基。每24h更换一次新鲜中肠和后肠分化培养基，直至96h 。
10，在立体显微镜下，可以看到明显的3D结构。使用200μl移液器吸头从每个孔中收集球状体，并将大约50个球状体集中到1.5ml微量离心管中。
中肠和后肠球状体生长成人肠类器官
11，收集球状体后，将微量离心管垂直放置在管架上10min，此时球体通过重力沉降到离心管底部。吸出上清，控制总体积在25μl左右。
12，将冻存的Matrigel在4℃下过夜解冻，添加B-27补充剂(终浓度1×)、R-spondin1(终浓度500ng/ml)，Noggin(终浓度100ng/ml)和EGF(终浓度100ng/ml)，用移液器吹打混匀，配制成肠基质胶。
13，将球状体滴加在预冷的肠基质胶中，并将样品混匀，总体积将达到75μl(50μl基质胶+ 25μl培养基+球状体)。
14，将混合物接种在4孔板中，注意需接种在孔的中心，避免接触侧壁。
15，将4孔板放入37℃，5%CO2的培养箱中孵育10min，使Matrigel固化。
16，向每个孔中缓慢滴加0.5ml肠道生长培养基，确保基质胶被完全覆盖。
17，每隔4天，或当培养基中的酚红变黄时，更换肠生长培养基。
肠类器官传代
18，在第14天左右，通过将肠类器官重新包埋在新鲜的Matrigel中，来实现传代。
19，在显微镜下观察类器官，吸出孔内的培养基，加入少量DMEM-F12培养基。
20，使用200μl移液器吸头用力上下吹打Matrigel 3-5次，释放Matrigel中的类器官。
21，在37℃，5%CO2的培养箱中培养组织14天，每4天更换一次肠道生长培养基。
图1. 人肠类器官的培养过程【2】
肠类器官的最新应用进展
肠道类器官可以在体内移植，作为再生医学的临床前工具。2022年2月日本学者Satoshi Watanabe等人【3】利用右旋糖酐硫酸钠给药，在结肠远端引发上皮损伤，随后将肠道类器官原位移植到受体小鼠的结肠中，实现了上皮细胞的重建。这一步骤可在10分钟内完成，为肠类器官治疗溃疡性结肠炎的临床试验奠定了基础。
图2. 肠类器官（绿色）在移植1周后，成功整合到小鼠上皮损伤的区域【3】
类器官作为一种研究模型，在发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等方面潜力巨大。但是，类器官培养技术建立过程中会面临多种挑战。
参考文献
【1】SATO, Toshiro, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature, 2009, 459.7244: 262-265.
【2】MCCRACKEN, Kyle W., et al. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nature protocols, 2011, 6.12: 1920-1928.
【3】WATANABE, Satoshi, et al. Transplantation of intestinal organoids into a mouse model of colitis. Nature Protocols, 2022, 1-25.
来源：“近岸蛋白 ”公众号，作者，Novoprotein。
说明：转载只为分享目的，如有侵权请联系删除，谢谢！
