稀释涂布平板法计数菌落数的操作及注意事项
发布时间:2024-07-24 浏览次数:2677
01、稀涂布平板法操作步骤
稀释涂布平板法是一种常用的微生物数量测定方法,它通过将样品进行一系列稀释,然后将不同稀释度的菌液涂布到固体培养基表面,经过培养后,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,从而估算原始样品中的活菌数量。具体步骤如下:
1)实验室准备:确保实验室环境清洁、干燥、无尘、无霉菌,操作台、器皿、试剂应清洗干净并消毒处理。实验室应备有必要的设备和器具,如移液器、量筒、加热器、平板计数器等。实验人员应穿戴干净、无菌的实验服装和手套。
2)样品处理:选择代表性、均匀的样品,并按照要求采集。样品应在规定时间内送达实验室,尽快进行处理。样品应在处理前进行预处理,如过滤、破碎、稀释等。
3)平板制备:准备平板和培养基,根据需要配置适当的培养基(不同微生物需要选择不同营养成分的培养基)。将平板培养基加热至沸腾,然后冷却至适宜的温度(通常为45-50℃)。将冷却好的培养基均匀地倒入空平板中,使其均匀分布在整个平板上,根据平板的大小,倾倒至培养基厚度约为0.5cm左右即可。除了自己倒平板外也可以使用商品化成品固体培养基。
4)稀释涂布:先稀释后涂布。将待测样品进行一系列梯度稀释,一般情况下10倍、100倍、1000倍等稀释。将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面,随后将平板平放于实验台上15-20min,使菌液渗透并固化,将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养(通常培养24-48h)。
5)菌落计数:培养后,统计菌落数目,计算出样品中的含菌数。计数原则:平板上菌落数30-300之间为合格。如果只有一个稀释度的平均菌落数符合要求,则以该稀释度平均菌落数除以涂布平板所用稀释液体积(0.1mL),乘以稀释倍数作为该样品的细菌总数。如果有两个稀释度的平均菌落数符合要求,则按照两者菌落总数之比来决定,如果小于2,取两者的平均值;如果大于2,取较小的菌落总数。
02、稀涂布平板法注意事项
① 整个过程需要保证在无菌条件下进行,以防止杂菌污染。
② 注意稀释液的准确性,避免误差。稀释比例应该根据菌液的浓度进行调整,通常使用10倍系列稀释法进行稀释。如果菌液浓度较高,可以采用更大稀释比例,以避免平板上出现过多的菌落。
③ 涂布平板时要均匀一致,以保证菌落计数的准确性。涂布时可以采用涂抹、划线或点植等方法,具体方法应根据实验要求和培养基性质选择。
④ 在计数时要选择菌落数稳定且分布均匀的平板进行计数,避免误差。
⑤ 在进行稀释涂布平板法时,需要保证实验的重复性。每个实验应该设置多个重复组(通常一个稀释度进行3-5次重复),以避免实验结果的偶然性和误差。
⑥ 在稀释过程中,要注意取液量要准确,并且每次稀释后,要将稀释液混合均匀,再进行下一步稀释。
⑦ 无论是涂布还是倾注接种,都要让微生物分布均匀,且尽量靠近中间,远离边缘,因为菌落生长在边缘时,不容易读取,且易连成片。
⑧ 设置对照,以排除操作过程中可能的污染。
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