多重PCR技术革新：快速鉴定大肠杆菌的三基因方案
发布时间：2024-10-08 浏览次数：434
大肠杆菌是一种性质极其多样的物种，成为一种模式生物，用于研究细菌的结构、代谢和行为，并广泛用于实验室中的遗传改造研究。它进化适应了人类肠道，既作为共生种，也作为致病种。目前我们对为何该物种表现出致病性和非致病性行为的理解仍然有限。研究表明，这可能是由于三种情况之一：获得新基因、抗毒力基因的失活，或基因功能发生变化的点突变。由于基因组与菌株表型之间的复杂关系，很难制定出单一的分类系统。系统发育上的归类与表型之间没有明确的联系，分类体系的区分能力差，且临床菌株范围广泛。
随着新的体外分析数据的快速涌入，研究人员经常面临两个问题：当前方法需要频繁重新评估，并且设计新的、可靠的诊断工具极其困难。迄今为止，已经提出了许多诊断测试方法，包括生化测试、血清分型、噬菌体引发的溶解实验，或不同变种的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）方法。
目前，已经开发了多种PCR检测大肠杆菌的方法。最常见的分子靶标包括在大多数大肠杆菌菌株中存在的编码酶的基因。两种通常用于PCR检测的基因是β-D-半乳糖苷酶（lacZ）和β-D-葡萄糖醛酸酶（uidA）。利用uidA基因可以用于分类那些缺乏酶活性但仍然具有基因序列的大肠杆菌。然而，研究表明，uidA和lacZ基因并不特异于大肠杆菌。此外，区分侵袭性大肠杆菌（Escherichia coli, EIEC）和与其密切相关的志贺氏菌也很困难，因为这两种细菌在生化和血清学上构成了独特的大肠杆菌病原变种。通常通过引物靶向lacY（乳糖通透酶）基因来区分这两个属，但研究表明该基因并不唯一特异于大肠杆菌。
近日，波兰罗兹Proteon Pharmaceuticals公司生物信息学和遗传学部Jarosław Dastych团队在Microbiology Spectrum期刊上发表了题为：Novel multiplex-PCR test for Escherichia coli detectiony论文。
为了解决该问题，本研究提出使用cydA（细胞色素bd复合物的一部分）、lacY（编码乳糖通透酶的基因）和ydiV（调节细菌运动的基因）这三个基因为多重PCR的靶点。通过这三个基因的组合，可以生成指定大小的三个扩增子，表明受试菌株属于大肠杆菌物种。
在该研究中，研究人员决定靶向三个基因：cydA（编码细胞色素bd-I泛醌氧化酶亚基1的基因）、lacY（编码乳糖通透酶的基因）、ydiV（基因产物参与群体感应和运动调节）。为了准备引物，从NCBI数据库中获取了这些基因的序列，这些序列来自1171个完整的大肠杆菌基因组。使用MAFFT进行多重序列比对，选择保守片段，并基于这些片段构建了用于新型多重PCR测试的引物。
然后，我们在一个由47370个不同肠杆菌科基因组组成的大型数据集上使用体外PCR（in silico PCR, isPCR）对这些引物进行了测试。结果显示，在19802个大肠杆菌数据集中，我们检测到了18963株大肠杆菌，灵敏度为95.76%。在27568个非大肠杆菌基因组中，有27427株未被检测到，特异性为99.49%。整体准确度达到了97.93%。该新方法显示出很高的分辨能力，能够有效区分大肠杆菌和非大肠杆菌。特别值得注意的是，与其他诊断方法相比，该方法在区分大肠杆菌和志贺氏菌方面表现出色。
在相同的数据集上使用其他研究人员提出的条件进行了isPCR，并根据敏感性、特异性和准确性将这些方法与本研究提出的多重PCR进行了比较。
本研究开发的多重PCR显示出与之前发表的检测方法相当，甚至略高的准确性（97.93%）。将志贺氏菌与大肠杆菌区分开仍然是一个诊断难题。我们的方法对志贺氏菌属的特异性为95.93%，高于其他方法。
图1 散点图，其中x轴表示灵敏度/召回率（检测到的大肠杆菌的比例），而y轴表示特异性（正确检测的比例）。点越靠近右上角，准确度越高。这些参数是根据对肠杆菌科数据集执行的isPCR计算得出的。点填充的颜色表示测试的检测方法，与框中的图例相对应。点越靠近右上角，准确度越高。
图2 显示了不同大肠杆菌检测方法的预测准确度的条形图。
下一步是对设计的多重PCR进行实验室条件下的验证。为此，提取了20株大肠杆菌和20株非大肠杆菌菌株的基因组DNA。为了检查获得真阳性结果的可能性，使用了20株大肠杆菌菌株的基因组材料。所有测试的样本均成功扩增了用于鉴定大肠杆菌所需的三个基因（如图3所示），获得真阳性结果的概率为100%。
图3 cydA、lacY、ydiV基因在细菌菌株基因组DNA上多重扩增后的PCR产物（2%琼脂糖凝胶电泳）。NTC—无模板对照，PC—阳性对照。M—marker；图左侧以bp为单位显示分子大小标记的大小。
为了检查获得真阴性结果的可能性，使用了20株非大肠杆菌的肠杆菌目菌株的基因组DNA。测试的所有样本均未显示出三个基因的扩增，因此未获得假阳性结果，真阴性结果的概率为100%。
为了确定对特定样本进行技术复现的结果总和与测试样本数量之比，使用了10株被鉴定为大肠杆菌的菌株和10株被鉴定为非大肠杆菌的菌株。每个菌株进行了10次技术重复，成功复现真阳性或真阴性结果的概率为100%。
图4 cydA、lacY、ydiV基因在细菌基因组DNA上多重扩增后的PCR产物（2%琼脂糖凝胶电泳）。NTC—无模板对照，PC—阳性对照。M—marker；图左侧以bp为单位显示分子大小标记的大小。
为了评估正确诊断结果所需的最小DNA量，使用了八种不同浓度的大肠杆菌基因组DNA（每次反应加入110-0 ng的DNA）。凝胶电泳结果如图5所示，除了0 ng（无模板对照——NTC）之外，每个浓度下均获得了三个基因的扩增产物，足以做出正确的诊断。
图5 cydA、lacY、ydiV基因在大肠杆菌不同量基因组DNA上多重扩增后的PCR产物（2%琼脂糖凝胶电泳）。NTC—无模板对照，PC—阳性对照。M—标记物；图左侧以bp为单位显示分子大小标记物的大小。
PCR测试用于细菌混合物时，可能会从三个不同的细菌基因组中检测到每个扩增子之一，从而导致假阳性信号。这种局限性通常出现在其他多基因检测方法中，而单基因检测方法则没有这个问题。尽管单基因检测方法可能较为方便，使用靶向多个基因（cydA、lacY和ydiV）的引物对可以确保在按程序执行的情况下减少假阳性检测的可能性，且每个检测到的扩增子还提供了代谢相关的信息。综上所述，该测试可用于快速、可靠地识别大肠杆菌，例如用于疑似败血症、新生儿脑脊液感染和脑膜炎等的临床诊断中。
论文来源：https://doi.org/10.1128/spectrum.03773-23
来源：微生物安全与健康网，作者~段子璇。
