稀释涂布平板法计数微生物的四大误区
发布时间：2024-10-08 浏览次数：2017
今天要跟大家分享的是一篇关于平板菌落计数的文献，虽然这篇文章更多的是针对应试的，但是个人觉得对于我们在工作和科研实验中的实际操作也是挺有用的。特别是对单位换算，样品稀释操作不是很清楚的小伙伴应该会有一定帮助。
稀释涂布平板法计数微生物的计算公式为：
每克样品中的菌株数 ＝ （Ｃ ÷ Ｖ） × Ｍ，Ｃ 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，Ｖ 代表涂布平板时所用稀释液的体积，Ｍ 代表稀释倍数。
误区1 对平均菌落数的理解
公式中的 Ｃ 不一定是所有实验所得菌落数的平均值。 为增强实验说服力和减小实验误差，实验需设置对照实验和重复实验。若空白对照有菌，说明实验可能被污染，相当于质控不在控，这种情况下不能将平板菌落数去平均值，而是需要分析可能污染的原因并重新进行实验。
重复实验是将同一稀释度的稀释液至少涂布３个平板（一般设置３—５ 个平板），选择菌落数在 30—300 的平板计算平均菌落数。若重复实验中某个平板的菌落数与其他差别甚远，如四个平板的菌落数分别为 42、200、256、234，菌落数42与其他数值差异过大，说明该平板操作过程有误，则该菌落数应舍弃。 若舍弃后不足三个平板，不能用菌落数相近的两个平板取平均值，应找到原因并重做实验。 若计算每克样品中的某种菌株数，则 Ｃ应代表某一稀释度下平板上生长的符合该菌菌落特征的菌落数的平均值，培养基上其他菌种形成的菌落数不能一并计算在内。 如检测１L待测水样中的大肠杆菌数目只统计大肠杆菌菌落数的平均值。
误区二 对稀释倍数的判定
平板中菌落数过少会导致计数误差过大，菌落数过多又会造成计数困难，为确保有效活菌数的准确测定，应合理设定稀释倍数。待测样品中微生物数量越多，所需稀释倍数越大，而微生物数量越少，所需稀释倍数越小。
如测定土壤中细菌数量，一般选用１０４、１０５和 １０６ 倍稀释；测定放线菌数量，一般选用１０３、１０４和 １０５倍稀释；测定真菌数量，一般选用 １０２、 １０３和 １０４倍稀释；测定自来水中大肠杆菌数量，一般不稀释，直接进行涂布培养。
图源：人教版高中生物教材
误区三 对体积与质量的单位换算
微生物计算公式中的 Ｖ 代表涂布平板时所用稀释液的体积，通常为0.1 ｍＬ，但若待测样品中微生物数目较少，接种0.1mL经培养后平板上菌落数达不到30，可增大接种量（如接种 １ ｍＬ）。
1cm³=1000μＬ=1mL=0.001L
体积和质量的换算公式是：体积 ＝ 质量÷ 密度（Ｖ ＝ ｍ／ ρ），水的密度是 １ ｇ／ cm³，则质量为１g的水的体积是 １ cm³即１ｍＬ。
误区四 对统计误差的分析
从稀释涂布平板计数的原理分析，运用该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因为样品一般不易完全分散成单个细胞，当两个或多个活细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。从稀释涂布平板计数的过程分析，稀释倍数是否合适、涂布是否均匀、培养环境是否能保证微生物正常生长、计数是否存在漏计或重复计数等情况都会影响统计结果。 除此之外，还要考虑培养时间对菌落数目的影响，菌落数目需要每隔一段时间统计一次，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足遗漏菌落的数目。
知其然，还要知其所以然。
参考文献：张艳娟,陈兆亮,郭建坤.稀释涂布平板法计数微生物的四大误区[J].中学生理科应试,2024,(04):52-53.
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