化妆品微生物检验总则中检院征求意见稿：对比分析

2026年2月6日，中检院发布了关于公开征求《化妆品中微生物检验方法总则（征求意见稿）》等6项化妆品标准意见的通知，涉及化妆品中微生物检验方法总则、菌落总数检验、霉菌和酵母菌的检验、耐热大肠菌群检验、金黄色葡萄球菌检验、洋葱伯克霍尔德菌群检验。本文结合原2015年版进行了对比解读。

征求意见稿对检测室、检测人员、菌株、培养基质量控制提出了要求，并对样液制备方法就防腐剂中和等方面作了修订和增加。总体而言，较旧版有了明显的提高，对化妆品生产企业的微生物检测提出了新的要求。那些一间房、一台超净工作台、一个高压锅、两台烘箱、一个员工加一件白大褂的微生物检测场景，将成为历史。检测能力也将随之登上新的台阶。

化妆品中微生物检验方法总则

1  范围

本部分规定了化妆品微生物学检验的基本要求。

本部分适用于化妆品样品的采集、保存、供检样品制备及质量控制。（蓝色字体为新增）

一、本小节全为新增的模块

2  实验室基本要求

2.1  环境

2.1.1 实验室环境应不影响检验结果的准确性。

2.1.2 实验室的工作区域应与办公室区域应明显分开。

2.1.3 实验室工作面积和总体布局应能满足从事检验工作的需要。

2.1.4 病原微生物分离鉴定工作应在二级生物安全实验室（Biosafety level 2, BSL-2）进行，实验室内环境应符合二级生物安全实验室的要求。

2.2  人员

2.2.1 检验人员应具有相应的微生物专业培训经历，具备相应的资质，能够理解并正确实施检验。 

2.2.2 检验人员应掌握实验室生物检验安全操作知识和消毒知识。

2.2.3 检验人员应在检验过程中保持个人整洁与卫生，防止人为污染样品。

2.2.4 检验人员应在检验过程中遵守相关预防措施的规定，保证自身安全。

2.2.5 有颜色视觉障碍的人员不能执行涉及到辨色的实验。

2.4  菌株

2.4.1 应使用微生物菌种保藏专门机构或同行认可机构保存的、可溯源的标准或参考菌株。

2.4.2 必要时，可对从化妆品或环境分离、纯化、鉴定的，未在微生物菌种保藏专门机构登记注册的原始分离菌株（野生菌株）进行系统、完整的菌株信息记录，包括分离时间、来源和菌株的主要表型特征等信息。

2.4.3实验室应保存能满足实验需要的标准或参考菌株，在购入和传代保藏过程中，应进行验证试验。

3  培养基及试剂的质量控制

化妆品微生物检验用培养基的质量评价项目包括促生长能力、抑制能力及生化特性，各培养基的检验项目及所用的菌株见表1~4。表中菌株可采用其他等效菌株进行检测。

实验室应针对每批次使用的培养基开展质量控制和评价工作。若生产商能提供由具备相应检验能力且取得国家相关认证认可资质的检验机构出具的同批次产品检验报告，实验室可保留相关证明文件，并根据实际需求对该批次培养基的质量予以评估。对于表2~4中未包含的培养基和试剂，实验室可根据其性能，参考表2~4中建立的方法进行评价。

3.1  培养基的促生长能力

3.1.1 固体培养基

将表2中规定的试验菌株接种到非选择性肉汤（如TSB）培养基中，培养过夜或采用其他方法（如培养18~24 h），制备10倍系列稀释的菌悬液。进行生长率测试时，细菌和酵母菌每平板的接种水平为50~250 CFU，霉菌每平板的接种水平为30~150 CFU。

选择适宜稀释度的工作菌悬液 0.1 mL，均匀涂布接种于待测培养基平板和参比培养基平板，也可使用螺旋涂布法或倾注法进行接种。每一稀释度接种两个平板，按表2规定的条件培养。

参考菌落总数的要求，选择菌落数适中的平板进行计数，将两块平板的平均值按下列式（1）计算生长率。生长率一般应不小于0.5。

式中：P_R——生长率；

N_S——待测培养基平板上的菌落总数平均值；

N_O——参比培养基平板上的菌落总数平均值。

3.1.2 液体培养基

将表3中指定的试验菌株接种到非选择性肉汤培养基中，培养过夜或采用其他方法（如培养18~24 h），制备10倍系列稀释的菌悬液。

在装有10 mL待测培养基的试管中接种10~100 CFU的目标菌，接种体积不超过0.1 mL，同时接种两个平行管，混匀。将相同体积的目标菌菌悬液（与试管接种同一稀释度）倾注平板（或适宜稀释度0.1 mL涂布平板），接种两个平板，作接种量计数用。按标准规定的培养时间和温度进行培养。

待测培养基经增菌培养，稀释10倍后，取0.1 mL涂布TSA平板，平板上的菌落数应不少于100 CFU。

3.2  培养基的抑制能力

3.2.1 选择性固体培养基

将表2指定的试验菌株接种到非选择性肉汤培养基中，培养过夜或其他方法作为工作菌悬液。用1 μL接种环取工作菌悬液1环，在待测培养基表面划六条平行直线（如图1），同时接种两个平板，按表2指定的条件培养。培养后对培养基计算生长指数G。选择性固体培养基的生长指数G一般小于或等于1，至少应小于5。

每条有比较稠密菌落连续生长的划线计为1分，每个培养皿上最多为6分。如果仅一半的线有稠密菌落生长，则计为0.5分。如果划线上没有菌落生长、生长量少于划线的一半或菌落生长微弱，则计为0分。记录每个平板的得分总和即为G值。

3.2.2 选择性液体培养基

在装有10ml待测培养基的试管中接种1000~5000 CFU的试验菌，按标准规定的培养条件培养。将培养物稀释10倍后，取0.1 mL均匀涂布或螺旋涂布接种到TSA平板。培养后，TSA平板上的菌落总数应小于100 CFU。

3.3 鉴定培养基

将表4中指定的测试菌株接种到非选择性肉汤培养基中，培养过夜或采用其他方法（如培养18~24 h），制备成约10⁷ CFU/mL的菌悬液。吸取0.05 mL（或1滴）菌悬液加入待测培养基中，按表4指定的培养时间和温度进行培养。需加指示剂的试验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，再观察结果，结果解释参照表4。

3.4 参比培养基

参比培养基系指按培养基配方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以评价化妆品微生物检验用培养基的质量。

细菌的参比培养基可选用胰蛋白胨大豆琼脂，霉菌和酵母菌的参比培养基可选用沙氏葡萄糖琼脂，参比培养基的质控标准见表1，参比培养基的具体验证方法可参考3.1.1。

表1胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）与沙氏葡萄糖琼脂（SDA）参比培养基的质控标准

表2 化妆品微生物检验用固体培养基的质量控制标准（略）

表3 化妆品微生物检验用液体培养基的质量控制标准（略）

表4 化妆品微生物鉴定用培养基的质量控制标准（略）

二、本小节内容为有修改

4 样品的采集及注意事项

4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应从不少于 2 个包装单位的取样中共取 10g 或 10mL。包装量小于 20g 的样品，采样时可适当增加样品包装数量。

4.2 供检样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。   改为：样品在采集、运输和保存的过程中，应保持样品的原有状态，防止样品中原有微生物的数量变化。

4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应置于室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。  改为：接到样品后实验室应按要求尽快检验。若不能及时检验，应采取必要的措施保持样品的原有状态，防止样品中目标微生物因客观条件的干扰而发生变化。

4.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生物检验，再将剩余样品做其他分析。

4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。

（说明：正常黑色字体表示原版与征求意见稿相同。灰色字体带中划线，表示为原版内容，征求意见稿删除了。浅蓝色字体的表示征求意见稿修改后的或新增的。）

5  样品检验

5.1  样品前处理  （除本条原版为“供检样品的制备”，部分修改为外，5 “样品检验”项下其余条款全为新增）。

5.1.1 液体样品

5.1.1.1 水溶性的液体样品：用灭菌吸管吸取10 mL样品，加到90 mL灭菌生理盐水或含有中和剂的稀释液（以下简称稀释液）中，混匀后，制成1:10检液。

5.1.1.2 油性液体样品：称取10 g样品，先加5 mL灭菌液体石蜡混匀，再加10 mL 灭菌的吐温80，在40~44℃水浴中振荡混合10 min，加入灭菌的灭菌生理盐水 稀释液 75 mL（在40~44℃水浴中预温），在40~44℃水浴中乳化，制成1:10的悬液。

5.1.2 膏、霜、乳剂半固体状样品

5.1.2.1 亲水性的样品：称取10 g样品，加到装有玻璃珠及90 mL 稀释液 灭菌生理盐水 的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15min，用其小清液作为  制成1:10的悬液。

5.1.2.2 疏水性样品：称取10 g样品，置于灭菌的研钵中，加10 mL灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入10 mL灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70 mL稀释液  灭菌生理盐水，在40~44℃水浴中充分混合，制成1:10检液。

5.1.3 固体样品

称取10 g样品，加到90 mL稀释液  灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，用其小清液 作为1:10的检液。

使用均质器时，则采用灭菌均质袋，将上述水溶性膏、霜、粉剂等，称取10 g样品加入90 mL灭菌生理盐水，均质1~2 min；疏水性油性液体、膏、霜及眉笔、口红等，称取10 g样品，加10 mL灭菌液体石蜡，10 mL吐温80，70 mL稀释液 灭菌生理盐水，均质3~5 min。

三、本小节全为新增的模块

5.2  适用性试验

若需开展适用性试验，实验室可基于检品已有研究，参照以下程序进行。

5.2.1 染菌液的制备菌悬液及孢子悬液的制备也可采用标准物质。

5.2.1.1 细菌悬液制备

用接种环从菌种保存管中（或试管斜面上）取适量菌体，分区划线接种于TSA平板，36±1℃培养18~24 h。用接种环取第1代培养物，分区划线接种于TSA平板，36±1℃培养18~24 h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，分区划线接种于TSA平板，36±1℃培养18~24 h，即为第3代培养物。用无菌棉签取菌苔加入无菌生理盐水中，涡旋混匀。用无菌生理盐水将其稀释成约104 CFU/mL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2 h内使用，或在2~8℃保存不超过24 h。

5.2.1.2 白色念珠菌菌悬液的制备

用接种环从菌种保存管中（或试管斜面上）取适量菌体，分区划线接种于SDA平板，28±2℃培养48~72 h。用接种环取第1代培养物，分区划线接种于SDA平板，28±2℃培养48~72 h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，分区划线接种于SDA平板，28±2℃培养48~72 h，即为第3代培养物。用无菌棉签取菌苔加入无菌生理盐水中，涡旋混匀。用无菌生理盐水将其稀释成约104 CFU/mL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2 h内使用，或在2~8℃保存不超过24 h。

5.2.1.3 黑曲霉孢子悬液的制备

用接种环从菌种保存管中（或试管斜面上）取适量的菌体，分区划线接种于SDA平板上，28±2℃培养3~7 d。用无菌棉签取菌苔加入含0.05%(v/v)聚山梨酯80无菌生理盐水中，制备孢子悬液，轻轻振摇1 min 后，用无菌玻璃棉过滤除去菌丝。用含0.05%(v/v)聚山梨酯80无菌生理盐水将其稀释成约104 CFU/mL的孢子悬液。制备好的孢子悬液应当天使用或在2~8℃保存不超过7 d，使用前混合均匀，并在显微镜下观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。

5.2.2 检液的制备

参考5.1制备样品检液。

5.2.3 定量方法适用性试验

定量方法包括菌落总数、霉菌和酵母菌数检验。

5.2.3.1 染菌和稀释

使用表5中适用性试验用菌株，按下列要求进行检液的染菌和稀释。

• 试验组：取制备好的1:10检液10 mL，加入菌悬液不超过0.1 mL，混匀。其中细菌和酵母菌的染菌量为50~250 CFU/mL，霉菌的染菌量为30~150 CFU/mL。

• 检品对照组：取制备好的1:10检液10 mL，加入无菌稀释液0.1 mL，混匀。

• 菌液对照组：取无菌稀释液10 ml，加入与试验组等量的菌悬液，混匀。

将上述各组样品常温放置30 min±15 min后，按照菌落总数或/和霉菌和酵母菌数检验方法进行检验。

5.2.3.2 抑菌成分的去除或中和

若5.2.3.1中试验组菌落数减去检品对照组菌落数的差值大于菌液对照组菌落数的50%，则样品符合适用性的要求，反之则应采用下述方法消除样品的抑菌性：

（1）增加稀释液或培养基体积；

（2）加入适宜的中和剂；中和剂的筛选方法可参考化妆品防腐挑战测试评估技术指南6.3中和剂效果验证试验。

（3）将方法（1）（2）联合使用。

（4）采用薄膜过滤法；

薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45 μm，直径一般为50 mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。样品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应经过灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性检液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。疏水性检液， 其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持检液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。检液经薄膜过滤后，若需要用灭菌生理盐水或含有中和剂的稀释液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100 mL。总冲洗量一般不超过500 mL ，最多不得超过1000 mL，以避免滤膜上的微生物受损伤。 

取1:10检液1 mL（若样品中所含的菌数较多时，可取1:100、1:1000……检液），加至100 mL的灭菌生理盐水或含有中和剂的稀释液中，混匀，过滤。用适量灭菌生理盐水或含有中和剂的稀释液冲洗滤膜，冲洗完成后，将滤膜取出，过滤面朝上贴于培养基平板上，按对应检验方法的规定温度和时间进行培养，每个稀释度平行制备2张滤膜。

若上述方法均无法有效消除检品的抑菌作用，可判定该检品对试验菌具有较强的抗菌性，表明其不易受到此类微生物污染。在此情况下，可从所述四种方法中选择抑菌成分消除效果相对较彻底的方法，进行后续的检品检验。

5.2.4 定性方法适用性试验

定性方法包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐热大肠菌群和洋葱伯克霍尔德菌群检测。

取1:10检液10 mL，使用表5中相应质控菌株进行染菌，染菌量为10~100 CFU。按照相应定性检验方法进行检验。若能从染菌液检出质控菌株，则表明此检液制备法和检查方法适用，可用于后续检品检验；若未检出，则应参考5.2.3.2的方法消除检品的抑菌成分，并重新进行方法适用性试验。

6  记录与报告

6.1  记录

检验过程中应即时、准确地记录观察到的现象、结果和数据等信息。

6.2  报告

实验室应按照检验方法中规定的要求，准确、客观地报告每一项检验结果。

7  生物安全与质量控制

7.1  实验室生物安全要求

应符合GB 19489《实验室 生物安全通用要求》的规定。

7.2  质量控制

7.2.1 实验室应根据需要设置阳性对照、阴性对照和空白对照，定期对检验过程进行质量控制。

7.2.2 实验室应定期对实验人员进行技术考核。

8  检验后样品的处理

8.1  若有剩余被检样品，应在检验结果报告后，被检样品方能处理。

8.2  检出致病菌的样品应进行无害化处理。

8.3  检验结果报告后，剩余样品不进行微生物项目的复检。

原文链接：中检院关于公开征求《化妆品中微生物检验方法总则（征求意见稿）》等6项化妆品标准意见的通知  https://www.nifdc.org.cn/nifdc/xxgk/ggtzh/tongzhi/202602061040471911997.html

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