革兰氏染色法实验原理与详细步骤：G⁺与G⁻细菌鉴别的关键技术解析
发布时间：2026-04-17 浏览次数：61
革兰氏染色法（Gram Staining）是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive，G+）与革兰氏阴性（Gram Negative，G-）。
一、实验原理
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。（记忆口诀：杨紫）
革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
二、染液的配制
1.结晶紫染液：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中）20mL，1%草酸铵水溶液80mL，将两液混匀置24h后过滤即成。
2.卢戈氏碘液：碘0.33g，碘化钾0.66g，蒸馏水100mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100mL即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。
3.95%乙醇：用于脱色。
4.番红溶液：番红O2.5g，95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。
三、应用
应用于细菌检测，细菌的鉴别和分类，病毒的检测以及生物样品的特性分析。
四、实验步骤
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法如下：
1.制片：固定，操作同上；
2.初染：滴加草酸铵结晶紫染色1min，水洗；
3.媒染：滴加革兰氏碘液（碘-碘化钾溶液）染色1min，水洗；
4.脱色：滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后水洗；
5.复染：滴加番红染液染色3min，水洗并使之干燥；
6.镜检：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
五、影响因素及注意事项
1.假阴性
选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
2.假阳性
涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
3.涂片加热
如用火焰固定涂片时，将涂面向上，通过火焰数次，以手接触玻片，稍感烫手时即可。要防过热，否则使细菌变形或影响染色反应。
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