一文读懂 WS/T 10009—2023 定量中和剂鉴定试验：消毒效果评价的"守门员"

发布时间：2026-08-26 浏览次数：14 分享：

在消毒产品检测实验室里，有一个环节常被忽视却至关重要——中和剂鉴定试验。

中和剂选错，残留的消毒剂会继续杀灭试验菌，在消毒剂效力评价中消毒效果被“高估”；中和剂本身或者中和产物存在毒性，又会抑制微生物复苏，让真实消毒效果被“低估”。

简单理解：中和剂就像 "刹车"，要及时刹住消毒剂的杀菌作用，但又不能 "误伤" 存活的微生物。因此，正式开展悬液 / 载体定量杀菌试验之前，必须完成定量中和剂鉴定试验，验证所选中和剂体系完全适配本次检测。

今天带大家拆解标准WS/T 10009—2023中 5.1.5.1「定量中和剂鉴定试验」核心操作、分组逻辑、判定要求，帮实验室避开试验坑。

一、为什么要做中和剂鉴定？

消毒效果试验（悬液或载体定量杀菌试验）结束后，必须使用中和剂及时终止消毒剂的持续杀菌作用，才能把存活的微生物计数出来。但中和剂本身可能是把"双刃剑"，合格的中和剂必须同时满足3个条件：

中和能力达标：可充分中和残留消毒剂，终止消毒剂持续抑菌、杀菌作用，让受损微生物可以正常复苏生长；
中和剂本身无毒：中和剂试剂本身，不会对试验微生物产生抑制或杀灭；
中和产物无毒：消毒剂与中和剂反应生成的产物，同样不能抑制微生物生长。

因此，在正式开展任何一项消毒效果鉴定之前，须先按中和剂鉴定试验的要求，用定量中和剂鉴定试验验证所选中和剂确实适用——这本身是标准强制的前置条件。

二、需要准备哪些试剂耗材？

试剂： 实验菌菌悬液和菌片、稀释液、培养基、标准硬水、候选中和剂（见附录 A）、有机干扰物。

设备及耗材： 刻度吸管（1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL）、平皿、恒温水浴箱、涡旋振荡仪等。

图1 菌片检测流程

三、实验设计原则

1、鉴定所用消毒剂浓度，必须采用杀菌试验的最高使用浓度；

2、不同微生物要分别开展鉴定：细菌繁殖体可在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌任选其一；细菌芽孢、白色念珠菌、黑曲霉菌、分枝杆菌，必须单独做中和剂鉴定；

3、悬液鉴定的结果可以用于载体试验；载体鉴定结果不能反向用于悬液试验；

4、整套试验需要重复3 次，每一次全部达标才算合格。

四、核心：四个试验组分别管什么？

试验设四组，每组都有不可替代的特定意义，不得任意删减：

组别	组成	它验证什么
第 1 组	中和剂 + 菌悬液（或菌片）	检验中和剂本身对试验菌是否有毒性
第 2 组	（消毒剂 + 中和剂）+ 菌悬液（或菌片）	检验中和剂中和能力，以及中和产物是否会抑制细菌生长
第 3 组	稀释液 + 菌悬液（或菌片）	阳性菌对照，获得无干扰条件下，试验菌正常存活水平
第 4 组	稀释液 + 中和剂 + 培养基	阴性对照，排查培养基、试剂是否存在污染，本组必须无菌生长

记忆口诀：

1 看中和剂毒不毒，2 看中和能力强不强，3 看菌本来活得好不好，4 看试剂干不干净！

菌量控制指标：

悬液定量鉴定：试验菌悬液最终菌量控制在50 CFU/mL～300 CFU/mL；
载体定量鉴定：菌片回收菌量控制2.5×10² CFU /片～1.5×10³ CFU /片。

五、操作要点：悬液定量 VS 载体定量鉴定

悬液定量鉴定试验操作

将试验菌悬液与等体积、适宜浓度的有机干扰物混合，使菌量为 2.5×10³ ~ 1.5×10⁴ CFU/mL，作为试验菌悬液。四组操作要点：

组别	操作要点
第 1 组	0.4 mL 标准硬水 + 4.5 mL 中和剂，20℃±1℃ 水浴 5 min，加 0.1 mL 试验菌悬液，作用 10 min，吸取 1.0 mL 接种于 2 个平皿，进行活菌计数
第 2 组	0.4 mL 消毒剂 + 4.5 mL 中和剂（0.5 mL 消毒剂 + 4.4 mL 中和剂），水浴 5 min，加 0.1 mL 菌悬液，作用 10 min，吸取 1.0 mL 接种于 2 个平皿，进行活菌计数
第 3 组	0.4 mL 标准硬水 + 4.5 mL 稀释液，水浴 5 min，加 0.1 mL 菌悬液，作用 10 min，吸取 1.0 mL 接种于 2 个平皿，进行活菌计数
第 4 组	分别吸取稀释液、标准硬水与中和剂各 1.0 mL 于无菌平皿，倒入同批次培养基 15~20 mL，培养观察

载体定量鉴定试验操作

载体（菌片）试验回收菌量控制在 2.5×10² ~ 1.5×10³ CFU/片。

1~3 组：试管加入 5.0 mL 对应液体（中和剂 / 中和产物溶液 / 稀释液），水浴 5 min；投入 1 张菌片充分浸透，作用 10 min；涡旋振荡 20 s（手掌振打 80 次）；吸取 1.0 mL 接种 2 个平皿做活菌计数。

第 4 组操作和悬液法完全一致。

六、中和剂合格判定标准（全部条件同时满足）

必须同时满足以下条件，中和剂方可判为合格：

a）第 1、2、3 组有相近数量的试验菌生长：悬液体系菌量在 50 ~ 300 CFU/mL，载体体系在 2.5×10² ~ 1.5×10³ CFU/片。其组间菌落数误差率 Pz 不超过 15%。
b）第 4 组无菌生长；否则应更换试剂，重新试验。
c）试验重复 3 次，每次均应符合以上条件。

组间菌落数误差率按下式计算：

菌落数误差率计算公式

式中：

Pz —— 组间菌落数误差率（%）；
X —— 三组间菌落平均数；
Xi —— 各组菌落平均数（CFU）。

七、注意事项

a）各组均有特定意义，不得任意删减；

b）严格无菌操作，保持试验用液和器材无菌，注意更换吸管；

c）实验组序应按本文件执行；

d）中和剂鉴定试验应根据正式杀灭试验选择（或设计）：悬液鉴定结果可用于载体试验，载体鉴定结果不可用于悬液试验。

附表：试验所需相关产品列表

产品货号	产品名称	规格
QSX001	金黄色葡萄球菌ATCC6538（金属载体）	1×10⁶~5×10⁶cfu/片；100片/盒
QSX002	大肠杆菌8099（金属载体）	1×10⁶~5×10⁶cfu/片；100片/盒
QSX003	金黄色葡萄球菌ATCC6538（布片载体）	1×10⁶~5×10⁶cfu/片；100片/盒
QSX004	大肠杆菌8099（布片载体）	1×10⁶~5×10⁶cfu/片；100片/盒
022119	无菌检验用洗脱液(含PBS)	250 g/瓶
022115	胰蛋白胨生理盐水溶液(TPS)	250 g/瓶
022118	磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L，pH7.2）	250 g/瓶
C22118G1	磷酸盐缓冲培养管（PBS，0.03moL/L，pH7.2）	4.5mL×20支/盒
C22118G2	磷酸盐缓冲液（含1%吐温80+0.5%卵磷脂+0.5%硫代硫酸钠）	5mL×20支/盒
CP0310	生理盐水	9mL×20支/盒
022020	营养琼脂(羊血琼脂基础)	250 g/瓶
022020P1	营养琼脂(羊血琼脂基础)(颗粒型)	250 g/瓶
024089	营养琼脂平板(NA培养基)	90mm×20个/盒
022010	营养肉汤培养基(NB）	250 g/瓶
022010P1	营养肉汤(NB)(颗粒型)	250 g/瓶
022012	营养肉汤培养管	9mL×20支/盒
028075	胰蛋白胨大豆琼脂培养基	250 g/瓶

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