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【新！】食品微生物检验GB4789.2-2022菌落总数测定及注意事项
发布时间：2020-08-28 浏览次数：32760 分享：
一、菌落总数定义和卫生学意义
•菌落总数定义：指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的菌落数
•卫生学意义：菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
二、新标准概况
2022年06月30日发布 2022年12月30日实施
 | 本标准与ＧＢ４７８９.２—２０１６相比，主要变化如下： —— 增加了附录Ｂ(菌落总数结果不同情况计算方法示例)； —— 修改了设备和材料； —— 修改了培养基和试剂； —— 修改了检验程序； —— 修改了操作步骤； —— 修改了附录 Ａ（pca配方标注主要营养成分）。 |
三、修订亮点
修订亮点:“增加菌落总数测试片”
四、HandyPlate测试片的质量控制
HandyPlate测试片质量控制标准依据
•GB4789.28-2013 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求
测试片使用步骤：
1、制备适宜浓度的测试菌液(可按GB4789.28自己制备，也可采用商品的定量菌株）
2、取1ml接种待测试测试菌片，另取1ml测试菌液倾注参比培养基TSA，按GB4789.28-2013附录D中平板计数琼脂（PCA）对应的质量控制标准上的培养条件进行。
3、计数待测测试片上和参比培养基TSA上的菌落数（下图为测试菌大肠埃希氏菌ATCC25922在菌落总数测试片和参比培养基上生长的结果）
选择菌落数适中的平板进行计数，按下列式（1）计算生长率。
式中：
PR——生长率；
NS——待测培养基平板上得到的菌落总数；
N0——参比培养基平板上获得的菌落总数。
参比培养基的选择：一般细菌采用TSA，一般霉菌和酵母采用沙氏葡萄糖琼脂，对营养有特殊要求的微生物采用适合其生长的不含抑菌剂或抗生素的培养基。
5、结果判定
依据GB4789.28-2013附录D中平板计数琼脂（PCA）对应的质量控制标准上质控评定标准各测试菌的生长率≥0.7，如测试的测试片各测试菌生长率≥0.7，则报告检验合格，否则，为不合格。
五、其他变更情况
其他一般修订内容：
| 2022版 | 2016版 | |
| 设备和材料 | 恒温装置：48℃±２℃ | 恒温水浴箱: 46 ℃±1 ℃ |
| 培养基和试剂 | 4.3 无菌磷酸盐缓冲液 4.4 无菌生理盐水 | 4.2 磷酸盐缓冲液 4.3 生理盐水 |
| 检验程序/操作步骤 | 6.1.2 液体样品稀释补充“或放入盛有225ml稀释液的无菌均质 袋中，用拍击式均质器拍打１min～２min，制成1:10的样品匀液” 6.1.5选择1~3个适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养皿内 6.1.6 及时将15mL~20mL冷却至46℃～50℃的平板计数琼脂培养基（可放置于48℃±２℃恒温 装置中保温）倾注培养皿，并转动培养皿使其混合均匀。 | / 2-3个适宜稀释度 及时将15mL~20mL冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱 中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。 |
| 菌落计数 | / | 每个稀释度的菌落数应采用两个平板的 平均数。 |
| 菌落总数的报告 | / | 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延 |
| 附录B | 新增:菌落总数结果不同情况计算方法示例” | / |
六、操作流程及注意事项
菌落总数检验流程图
操作注意事项
1：从样品的均质到倾注琼脂，应在尽快完成，避免影响结果；
2：检验所用物品需无菌和无残留的抑菌物质；
3：建议用磷酸盐缓冲液作为稀释液，因为磷酸盐缓冲液能更好地纠正食品样品中pH变化，对细菌具有保护作用；
4：高压灭菌后，培养基的琼脂会分层在底部，应摇匀后使用；
5：在培养箱中倒置培养，为防止中间平皿过热，高度不得超过6个平皿。测试片堆叠不超20片
七、结果计算
1. 结果计数
•可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。
•选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
•其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
•当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长势，则将每条单链作为一个菌落计数。
2. 结果计算
•若只有一个稀释度平板上的菌落数在30~300CFU之间,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中菌落总数结果，示例B1。
•若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算，示例B3。
•若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算，示例B4。
•若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算，示例B5。
•若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU 之间,其中一部分小于30CFU 或大于300CFU 时,则以最接近30CFU 或300CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算，示例B6。
•若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算，示例B2
表1 菌落总数结果计算与报告方式实例
编号 | 稀释倍数及菌落数 | |||||||
10-1 | 10-2 | 10-3 | 菌落总数 | 报告方式 | ||||
平皿1 | 平皿2 | 平皿1 | 平皿2 | 平皿1 | 平皿2 | （CFU/g或ml） | （CFU/g或ml） | |
1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ﹤1×10 | ﹤10 |
2 | 24 | 26 | 5 | 7 | 0 | 0 | 250 | 250或2.5×102 |
3 | 多不可计 | 多不可计 | 150 | 160 | 15 | 20 | 15500 | 16000或1.6×104 |
4 | 多不可计 | 多不可计 | 236 | 245 | 35 | 33 | 24955 | 25000或2.5×104 |
5 | 多不可计 | 多不可计 | 236 | 245 | 25 | 33 | 24476 | 24000或2.4×104 |
6 | 多不可计 | 多不可计 | 多不可计 | 多不可计 | 320 | 330 | 325000 | 330000或3.3×105 |
7 | 多不可计 | 多不可计 | 310 | 320 | 28 | 26 | 27000 | 27000或2.7×104 |
8 | 多不可计 | 多不可计 | 295 | 325 | 22 | 20 | 29500 | 30000或3.0×104 |
9 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 |
3. 结果报告
•菌落数小于100CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
•菌落数大于或等于100CFU 时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
•若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。（已删除）
•若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
•称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
八、质量控制和疑难解析
1. 样品处理时是否需调节pH?
答：菌落总数大部分细菌都是嗜中性的，在偏酸偏碱的环境中都不适宜生长，如果样品本身偏酸或偏碱，那接种后会改变平板琼脂培养基的pH，从而影响样品中大多数微生物的生长，影响检测结果的准确性。
2. 菌落蔓延怎么办？
答：首先需分析菌落蔓延的原因，一可能是样品中含有运动性强的细菌如：变形杆菌、芽孢杆菌等，二可能是倾注时琼脂培养基温度高，形成较多冷凝水，三可能是培养时没有倒置，冷凝水滴落所致。
解决办法：一、注意倾注培养基温度控制在40-45度之间，避免冷凝水形成；二、培养时需倒置；三覆盖一层培养基；四在培养基中添加ttc0.5%，三 、使用菌落总数测试片。
3. 菌落总数计数同一个稀释度一个在计数范围，一个不在计数范围，怎么计？
答：以在计数范围的平板菌落数乘以稀释倍数作为报告结果。例如：某样品10-1平板菌落数分别320、288，10-2稀释度平板菌落数26、20，则样品检测结果选取288进行报告，结果报告为2.9×10的3次方。
4. 平行两个板结果相差较大？
答：可能是样液未完全混匀，导致菌落分布不均匀；或者取样偏差较大，注意校准取样器具和取样操作细节。平板间、稀释度间菌落数误差率不宜超10%。
5. 低稀释度平板菌落数少于高稀释度平板菌落数的原因是？
答：一产品中含防腐剂或抑菌成分，二产品偏酸或偏碱。
6. 做菌落总数检测时，没有菌落是怎么回事？
答：一可能是样品经过灭菌处理，本身就没有菌；二是检测选择的稀释度过高；三样品含抑菌成分未做去干扰处理；四倾注培养基温度高或者培养条件不适宜等等。
7. 菌落总数的单位CFU与个有什么区别？
答：CFU是菌落形成单位，单不等于细菌个数，如两个相同的细菌细胞连在一起，那经过培养后这两个细菌细胞将会形成一个菌落。
8. 如何保证检测结果的有效性？
答：一检测过程需做空白对照，避免外源污染物影响；二检验用培养基使用前需进行质量确认；三检验过程所用器具经检定，操作规范减少误差。
Q-Strain定量质控菌株
九、所需培养基试剂和质控菌株
用途 | 货号 | 名称 | 规格 |
样品稀释 | CP0630 | 生理盐水 | 盒（袋装）225 mL×10袋 |
CP0511A | 磷酸盐缓冲液（PBS） | 盒（瓶装）225 mL×6瓶 | |
CP0640 | 磷酸盐缓冲液（PBS） | 盒（袋装）225 mL×10袋 | |
022117 | 磷酸盐缓冲液（PBS） | 瓶（干粉）250 g | |
CP0310 | 生理盐水 | 盒（管装）9 mL×20支 | |
平板计数 | 022070 | 平板计数琼脂（PCA） | 瓶（干粉）250 g |
CP0830 | 平板计数琼脂平板（PCA） | 盒（平板）90 mm×20 | |
022070P1 | 平板计数琼脂(PCA) | 瓶（颗粒）250 g | |
HANDYPLATE微生物测试片 | HP001 | 菌落总数测试片 | 20片/包 |
Q-Strain定量质控菌株 | QS011A | 大肠埃希氏菌（ATCC25922） | 110-1100 CFU/瓶 |
QS011B | 大肠埃希氏菌（ATCC25922） | (0.6-2.0)×107 CFU/瓶 | |
QS008A | 金黄色葡萄球菌（ATCC6538） | 110-1100 CFU/瓶 | |
QS008B | 金黄色葡萄球菌（ATCC6538） | (0.6-2.0)×107 CFU/瓶 | |
QS004A | 枯草芽孢杆菌（CMCC(B) 63501） | 110-1100 CFU/瓶 | |
QS004B | 枯草芽孢杆菌（CMCC(B) 63501） | (0.6-2.0)×107 CFU/瓶 |
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