RPA-CRISPR/Cas12a技术在大肠杆菌O157:H7现场快速检测中的应用
发布时间：2025-04-25 浏览次数：31 分享：
RPA-CRISPR/Cas12a技术的优势
RPA（重组酶聚合酶扩增）是一种等温扩增技术，能够在37℃至42℃的恒温条件下快速扩增DNA，具有操作简便、快速高效的特点。CRISPR/Cas12a系统则是一种基于CRISPR技术的基因编辑工具，能够特异性地识别并切割目标DNA序列。将RPA与CRISPR/Cas12a结合，不仅能够实现快速的DNA扩增，还能通过CRISPR/Cas12a的特异性识别能力，提高检测的准确性和灵敏度。
在最新研究中，研究人员通过优化RPA反应条件和CRISPR/Cas12a检测参数，包括引物设计、crRNA浓度和转切割时间等，成功将检测的视觉下限降低到10¹ CFU/g，比现有方法提高了10倍。这一技术不仅能够快速检测大肠杆菌O157:H7，还能有效抵抗食品基质中的PCR抑制剂，确保检测结果的可靠性。
注射器滤膜的创新应用
为了进一步提高检测的灵敏度，研究人员引入了注射器滤膜技术。通过将样本溶液通过注射器滤膜过滤，能够快速浓缩目标细菌，显著提高检测效率。实验结果表明，注射器滤膜能够在短短5分钟内将大肠杆菌O157:H7的浓度提高25倍，极大地缩短了检测时间。
注射器滤膜技术的优势在于其便携性和操作简便性。与传统的真空泵过滤设备相比，注射器滤膜无需复杂的设备和电源支持，适合在各种现场环境中使用。此外，注射器滤膜的浓缩效果显著，能够在短时间内将低浓度的大肠杆菌O157:H7浓缩到可检测水平，为快速检测提供了有力支持。
图1基于重组酶聚合酶扩增（RPA）的CRISPR/Cas12a系统的序列设计。筛选RPA引物（A）：第1行：泳道1 - 4展示了使用引物组1 - 5扩增的阳性对照，泳道1N - 4N描绘了使用引物组1 - 5扩增的非模板对照（NTC）。（B）crRNA设计，（C）CRISPR/Cas12a介导的RPA产物顺式切割，（C - 1）RPA产物未切割，（C - 2）CRISPR/Cas12a对来自线性化靶双链DNA的RPA产物进行CRISPR/Cas12a介导的顺式切割。M：50 bp分子量标记。
实验验证与结果
研究人员通过在生菜样本中人工接种大肠杆菌O157:H7，验证了RPA-CRISPR/Cas12a结合注射器滤膜技术的检测效果。实验结果表明，该技术能够在55分钟内完成从样本处理到检测结果的全过程，检测下限低至10¹ CFU/g，远低于传统qPCR方法的10² CFU/g。即使在样本中含有PCR抑制剂的情况下，RPA-CRISPR/Cas12a技术依然能够准确检测出大肠杆菌O157:H7的存在，而qPCR则因抑制剂的影响而无法检测到高浓度的目标细菌。
图2. RPA - CRISPR/Cas12a系统的评估。(A) RPA - CRISPR/Cas12a的特异性；泳道1 - 4：大肠杆菌O157:H7（美国典型培养物保藏中心编号43895、43889、35150和43890），泳道5 - 12：非大肠杆菌O157:H7（大肠杆菌、粪肠球菌、阪崎克罗诺杆菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和铜绿假单胞菌）。(B) RPA - CRISPR/Cas12a在纯培养物中的灵敏度，以及(C) 实时PCR的Ct值。NTC，非模板对照。不同小写字母表示相对荧光强度存在显著差异（P<0.05），不同大写字母表示Ct值存在显著差异（P<0.05）。
未来展望
本研究基于RPA-CRISPR/Cas12a和注射器滤膜的检测技术具有快速、灵敏、便携的特点使其非常适合用于现场快速检测，能够有效防止食源性疾病的传播。未来，研究人员计划将该技术应用于更多种类的食品样本中，进一步验证其在实际检测中的适用性和可靠性。
参考文献：Lee S Y, Oh S W. Rapid and visual detection of Escherichia coli O157: H7 using an RPA-CRISPR/Cas12a-based syringe filter[J]. Microchemical Journal, 2025, 208: 112624.
来源：微生物安全与健康网，作者~蔡伟程。
