基于钙黄绿素的闭管LAMP技术检测生肉沙门氏菌
发布时间：2025-04-28 浏览次数：25 分享：
在食品安全备受关注的当下，肉类中的沙门氏菌污染问题成为公众焦点。据统计，全球每年因沙门氏菌感染导致9380万病例，15.5万人死亡，在菲律宾，它更是食物中毒爆发的主要微生物原因。传统检测方法耗时费力，新型分子检测技术应运而生，其中，一种基于钙黄绿素的封闭管环介导等温扩增（LAMP）检测方法脱颖而出，为肉类沙门氏菌检测带来新希望。
传统检测困境：耗时费力且昂贵
传统的细菌培养检测方法一直被视为检测沙门氏菌的“金标准”，但它需要经过一系列复杂的生化和血清学测试，整个过程至少需要6天，耗费大量人力、物力和时间。分子检测技术如常规PCR虽然能实现高通量检测且耗时较短，但需要昂贵的设备、试剂以及专业技术人员操作，成本高昂。血清学检测方法虽有快速、经济等优点，但易受批次差异、交叉反应影响，准确性欠佳。这些问题在发展中国家尤为突出，迫切需要一种更高效、低成本的检测方法。
LAMP技术
LAMP技术由Notomi等人在2000年开发，为沙门氏菌检测开辟了新途径。它使用4-6种独立引物和Bst DNA聚合酶，在60-65℃的恒定温度下就能进行核酸扩增，相比常规PCR，反应速度更快，能在短时间内产生大量产物。而且，LAMP检测可以在封闭管内完成，减少了开盖操作带来的污染风险，还能通过比色、荧光或浊度等可视化方式直接判断结果，操作简单便捷，特别适合小型实验室和现场检测。
LAMP检测优化：更灵敏、更精准
研究团队针对肉类样本，对基于钙黄绿素的封闭管LAMP检测方法进行了优化。在反应体系中，精确调整了钙黄绿素、MnCl2和MgSO4的浓度，最终确定为64μM、1mM和5mM，使检测结果在扩增后呈现出明显的颜色差异，阴性为橙色，阳性为绿色，便于肉眼观察。同时，添加甜菜碱有效减少了非特异性扩增，提高了检测的特异性。优化后的LAMP检测在65℃反应60分钟，后续可选择80℃处理2分钟使酶失活，整个流程高效且稳定。
性能远超常规PCR
经过一系列实验验证，优化后的LAMP检测展现出卓越性能。在特异性方面，对多种沙门氏菌血清型和非沙门氏菌菌株检测时，只有沙门氏菌菌株出现扩增反应，证明其引物特异性良好。在灵敏度上，更是优于常规PCR。对于DNA稀释系列，LAMP检测能检测到低至10−5稀释度的DNA，比常规PCR灵敏度高10倍；在纯细菌培养检测中，LAMP检测的最低检测限为4.8×103 CFU/mL，相比常规PCR的4.8×107 CFU/mL，灵敏度提升了1000倍。
图1 肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）DNA 系列稀释后的 LAMP 和 PCR 扩增结果。(A) LAMP 扩增产物，阴性管呈橙棕色，阳性结果呈黄绿色。(B - C) 使用 10,000× SYBR® Safe 核酸凝胶染色剂染色后，通过琼脂糖凝胶电泳观察 LAMP 和 PCR 产物。试管和泳道 1 - 8：肠炎沙门氏菌肠炎亚种肠炎血清型 ATCC 49223M 的 DNA 从初始浓度 347 ng/μL 开始，依次稀释至10−8 , 10−7 , 10−6 , 10−5 , 10−4 , 10−3 , 10−2 , 10−1。泳道 L 和 M 分别为 1 kb 和 100 bp 的 DNA 标志物。
在对341份生肉样本的平行检测中，当LAMP检测与常规培养富集方法结合时，对生鸡肉、牛肉和猪肉样本的检测阳性率均达到100%，与常规PCR检测结果相当，且显著高于3小时缩短富集方案与LAMP检测结合的阳性率。这表明优化后的LAMP检测在结合常规培养方法时，能更灵敏、准确地检测出肉类中的沙门氏菌。
图2. 对341份生鸡肉、牛肉和猪肉样本（n=341）进行检测时，3小时缩短富集结合闭管LAMP检测（3小时LAMP）、常规培养结合优化闭管LAMP检测（培养-LAMP）以及常规培养结合PCR检测（培养-PCR）的阳性率。
前景展望
这种优化后的LAMP检测方法为肉类沙门氏菌检测提供了一种强大的补充或替代手段，不仅灵敏度高、特异性强，而且操作简便、成本较低，适合在资源有限的环境中推广应用。未来，随着技术的进一步发展，有望缩短检测前处理时间，简化上游操作步骤，降低检测成本，为全球食品安全保障发挥更大作用。对于消费者来说，这意味着能更快、更准确地了解肉类食品安全状况，减少因食用受污染肉类而患病的风险，让餐桌更加安全。
参考文献：Balaga K B, Pavon R D N, Calayag A M B, et al. Development of a closed-tube, calcein-based loop-mediated isothermal amplification assay to detect Salmonella spp. in raw meat samples[J]. Journal of Microbiological Methods, 2024, 220: 106922.
来源：微生物安全与健康网，作者~蔡伟程。
