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食品微生物检验GB4789.5-2012 志贺氏菌检验及注意事项

发布时间:2020-11-18      浏览次数:5266    分享:

一、志贺氏菌的生物学特性

生物学特性:志贺氏菌属细菌为革兰氏阴性短杆菌,长约2~3μm,宽0.5~0.7μm,无芽胞,无荚膜,无鞭毛,有菌毛,不运动;需氧或兼性厌氧,对营养要求不高,在普通培养基(如营养琼脂)上即能生长;最适生长温度35~37℃,适宜pH为6.4~7.8。发酵糖类产酸不产气(福氏和鲍氏志贺菌中的某些血清型偶可产生少量气体)。分为4个群:A群(痢疾志贺氏菌)、B群(福氏志贺氏菌)、C群(鲍氏志贺氏菌)、D群(宋内氏志贺氏菌)。

流行学特征:志贺氏菌产生强烈的内毒素(endotoxin,ET),是一种脂多糖和脂蛋白复合物,为志贺氏菌致病的重要致病因素。A群志贺氏菌Ⅰ型能产生一种毒性极强的细菌外毒素称为志贺毒素(Shigatoxin,Stx),与感染者中毒性腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒症等严重并发症的发生密切相关,其毒性可表现为神经毒性、细胞毒性和肠毒性。在我国以福氏和宋内志贺菌引起的菌痢最为常见。 病人和带菌者是细菌性痢疾的传染源,由于饮食从业人员的带菌,可以使食品污染而造成食物型爆发。由于污水渗入供水系统,也常造成水型的爆发。

二、志贺氏菌的检验

三、培养基原理解析

1. 志贺氏菌增菌肉汤培养基

培养基中除胰蛋白胨、葡萄糖外,加入新生霉素作抑菌剂,并加入少量的吐温80作增溶剂,以帮助样品的充分分散。

41℃厌氧培养有助于抑制其它杂菌生长。

2. 麦康凯琼脂培养基(MAC)

利用胆盐来抑制革兰氏阳性细菌的生长;利用乳糖发酵,中性红的颜色可把分解乳糖和不分解乳糖的细菌区分开。

志贺氏菌呈无色菌落,半透明,光滑,湿润,圆形,边缘整齐或不齐。

麦康凯琼脂培养(MAC)

3.木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐(XLD)琼脂培养基

脱氧胆酸钠可以抑制革兰氏阳性细菌和部分大肠杆菌,多数志贺氏菌不能发酵木糖,木糖的添加可将志贺氏菌与其它菌株区别开来,因此,志贺氏菌在XLD平板上呈现无色菌落,但少数发酵木糖的志贺氏菌在此平板上会被漏检,XLD平板对宋内志贺氏菌亦有轻度抑制作用。

志贺氏菌通常呈粉红色至无色,半透明,光滑,湿润,圆形,边缘整齐或不齐菌落。

木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐(XLD)琼脂菌落特征

4.志贺氏菌显色培养基

利用非志贺氏菌的特异性的酶,使其与酶底物结合形成不同颜色的菌落,而生化特性反应不活跃的志贺氏菌经22~28h培养后,则形成易于识别的白色-粉红色(与培养基颜色相近)的菌落。

志贺氏菌呈白色/清晰的菌落,大小约为1~3mm,周围培养基变红。

5.三糖铁琼脂培养基

该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1,只能利用葡萄糖的细菌,葡萄糖被分解产酸使斜面先变黄,但因量少,生产的少量酸。因接触空气而氧化,加之细菌生长利用培养基中含氮物质,生成碱性产物,故斜面后来又变红。底部由于厌氧状态,酸类不被氧化,仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌,则产生大量的酸,使整个培养基呈黄色。另外,因某些细菌能分解含硫氨基酸,生成硫化氢,硫化氢和培养基中的铁盐反应生成黑色的硫化亚铁沉淀。

三糖铁

6.靛基质试验

某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰吲哚,为红色化合物。

结果判读:阳性为滴加靛基质试剂后液面立即变玫红色; 阴性为滴加试剂后不变红色。

靛基质试验

7.尿素酶试验

具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素,产生大量的氨,使培养呈碱性,酚红指示剂在pH6.8时呈黄色,pH8.1呈粉红色。

结果判读:阳性为玫红色; 阴性为淡橙红色-淡黄色。

尿素酶试验

8.赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶试验

具有氨基酸脱羧酶的细菌,能分解氨基酸使其脱羧生成胺(赖氨酸→尸胺)和二氧化碳,使培养基变碱,使指示剂显示出来。

结果判读:阳性为试验管为绿色-蓝绿色,对照管变黄色; 阴性为试验管和对照管均变黄色,或均不变色。

赖氨酸脱羧酶试验阳性

9.糖(醇)发酵试验

绝大多数细菌都能利用糖(醇)类作为碳源和能源,但是它们在分解糖(醇)的能力上有很大的差异,有些细菌能分解某种糖(醇)并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来断定。

(指示剂为溴甲酚紫)结果判读:阳性为变黄色; 阴性为紫色。

甘露醇发酵试验

10.β-半乳糖苷酶

某些细菌可产生b-半乳糖苷酶,能分解邻硝基酚-b半乳糖苷(ONPG),生成黄色的邻硝基酚。

结果判读:阳性为黄色; 阴性为不变色-淡黄色。

ONPG生化管

11.  葡萄糖铵试验

鉴别细菌利用铵盐作为唯一氮源并分解葡萄糖的试验。溴麝香草酚蓝是指示剂,产酸时培养基由绿色变黄色。

结果判读:阳性为黄色; 阴性为绿色。

葡糖糖铵利用试验

12.  西蒙氏柠檬酸盐培养基

细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源,能在除柠檬酸盐外不含其他碳源的培养基上生长,分解柠檬酸盐生成碳酸钠,使培养基变碱性。

结果判读:阳性为蓝绿-蓝色; 阴性为绿色。

西蒙氏柠檬酸盐培养基试验

13.  粘液酸盐试验

某些细菌能利用粘液酸盐,分解产酸,使培养基中的溴麝香草酚蓝变黄色。

结果判读:阳性为黄色; 阴性为绿色-蓝绿色。

粘液酸盐试验

四、志贺氏菌的生化鉴定

生化反应

A群:痢疾志贺氏菌

B群:福氏志贺氏菌

C群:鲍氏志贺氏菌

D群:宋内氏志贺氏菌

ß-半乳糖苷酶

-a

-a

尿素

赖氨酸脱羧酶

鸟氨酸脱羧酶

-b

水杨苷

七叶苷

靛基质

-/+

(+)

-/+

甘露醇

+c

棉子糖

甘油

(+)

(+)

d

注:+表示阳性;-表示阴性;-/+表示多数阴性;+/-表示多数阳性;(+)表示迟缓阳性;d表示有不同生化型。

a痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性。

b鲍氏13型为鸟氨酸阳性。

c福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种。

附加生化鉴定

由于某些不活泼的大肠埃希氏菌(anaerogenic E.coil.)、A-D(碱性-异型Alkalescens-D isparbiotypes)菌的部分生化特征与志贺氏菌相似,并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集。需要进一步做葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36℃培养24 h~48 h)。

生化反应

A群:痢疾志贺氏菌

B群:福氏志贺氏菌

C群:鲍氏志贺氏菌

D群:宋内氏志贺氏菌

大肠埃希氏菌

A-D菌

 

葡萄糖铵

西蒙氏柠檬酸盐

d

d

粘液酸盐

d

d

注1:+表示阳性;-表示阴性;d表示有不同生化型。

注2:在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性,而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D(碱性-异型)菌至少有一项反应为阳性。

 

五、志贺氏菌的血清诊断

志贺氏菌属没有动力,所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体(O)抗原。菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原。

一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原

在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取一环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。

再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min,并对着黑色背景进行观察,如果抗血清中出现凝结成块的颗粒,而且生理盐水中没有发生自凝现象,那么凝集反应为阳性。

如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征,而其血清学试验为阴性的话,可挑取菌苔于1mL生理盐水做成浓菌液,100℃煮沸15 min~60 min去除K抗原后再检查。

六、所需培养基试剂

用途

货号

名称

规格

增菌

023141

志贺氏菌增菌肉汤

瓶(干粉)250g

SR0380

志贺氏菌增菌肉汤配套试剂(新生霉素)

盒(西林瓶)10支/盒

CP0730

志贺氏菌增菌肉汤(需加配套试剂)

盒(袋装)225 mL×10袋

平板分离

029999

木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(XLD)

瓶(干粉)250g

029999P1

木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(XLD)

瓶(颗粒)250g

CP0180

木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(XLD)

盒(平板)90 mm×20

022144

麦康凯琼脂

瓶(干粉)250g

024076

麦康凯琼脂培养基平板

盒(平板)90 mm×20

CRM011

志贺氏菌显色培养基

1000mL

CRM011A

志贺氏菌显色琼脂平板

盒(平板)90 mm×20

生化鉴定

022080

三糖铁琼脂(TSI)

瓶(干粉)250g

CP0080

三糖铁斜面

盒(管装)20支

026050

半固体琼脂

瓶(干粉)250g

075350A

半固体琼脂

盒(管装)20支

CP0150

营养琼脂

盒(管装)20支

024089

营养琼脂平板

盒(平板)90 mm×20

022020

营养琼脂

瓶(干粉)250g

022020P1

营养琼脂(NA)

瓶(颗粒)250g

023090

尿素琼脂培养基基础

瓶(干粉)100g

029100

40%无菌尿素溶液

盒(西林瓶)10支/盒

生化鉴定

075150

尿素(冻干)

盒(西林瓶)10支/盒

075280

赖氨酸脱羧酶培养基

盒(西林瓶)20支/盒

075270

L-鸟氨酸脱羧酶培养基

盒(西林瓶)20支/盒

075290

氨基酸脱羧酶对照培养基

盒(西林瓶)20支/盒

029110

无菌石蜡油

10 mL×1支

075180

β-半乳糖苷ONPG

盒(西林瓶)20支/盒

075140

水杨素(水杨苷)

盒(西林瓶)20支/盒

075160

七叶灵(七叶苷)

盒(西林瓶)20支/盒

075040

甘露醇

盒(西林瓶)20支/盒

075230

D-棉籽糖

盒(西林瓶)20支/盒

生化鉴定

022110

蛋白胨水(靛基质培养基,色氨酸肉汤)

瓶(干粉)100g

075240

蛋白胨水(靛基质培养基,色氨酸肉汤)

盒(西林瓶)20支/盒

029230

靛基质试剂

10 mL×1支

075840

甘油发酵管

盒(西林瓶)20支/盒

075260

葡萄糖铵

盒(西林瓶)20支/盒

023150

葡萄糖铵培养基

瓶(干粉)250g

075200

西蒙氏柠檬酸盐

盒(西林瓶)20支/盒

022120

西蒙氏柠檬酸盐培养基

瓶(干粉)250g

075521

粘液酸盐测试肉汤

盒(西林瓶)20支/盒

075522

粘液酸盐质控肉汤

盒(西林瓶)20支/盒