环境微生物分离菌株的鉴定
发布时间：2023-06-09 浏览次数：515
除了对环境（即空气、纯化水和设备表面）中的微生物进行检测和计数外，更重要的是对有代表性的环境微生物分离物进行鉴定，以检测变化的趋势。环境中微生物类型的明显变化可能表明偏离了环境正常控制水平。有几种鉴定方法可用于鉴定环境中的微生物菌株。
鉴定方法的类型
为了鉴定环境中的微生物分离株，通常使用以下鉴定方法：
推定
表型
系统发育
为了进行分离株的推定鉴定，可以使用以下推定方法，例如选择性/差异琼脂（即Vogel-Johnson琼脂，MacConkey琼脂，Cetrimide琼脂）上的颜色反应，革兰氏染色结果（例如，阳性或阴性以及形态——球菌、杆菌、酵母）和诊断测试（即，过氧化氢酶，凝固酶，溶葡萄球菌酶、杆菌肽、细胞色素氧化酶、氧化/发酵（O/F）试验）。
为了对分离物进行表型鉴定，通常使用以下方法：生化鉴定试剂盒和MALDI-TOF质谱。在生化鉴定试剂盒中使用碳利用和生化反应来鉴定属/种水平。MALDI-TOF质谱法生成分离物的蛋白质组指纹图谱，以完成属/种水平的鉴定。
对于细菌的鉴定，最常见的系统发育方法是16S rRNA测序。对于真菌的鉴定，最常见的系统发育方法是真菌内部转录间隔区（ITS2）和LSU-D2 rDNA测序。
革兰氏染色
对环境细菌分离物的第一个鉴定步骤是根据菌落形态特征（如颜色、形状、高度、表面和边缘），将代表性分离物培养到无菌的大豆酪蛋白消化琼脂培养基（SCDAM）上进行革兰氏染色。然而，需要注意的是，使用R2A琼脂或平板计数琼脂回收的来自水的分离菌可能需要在低营养琼脂上继代培养，以获得足够的生长，因为它们受到营养压力，可能无法在高营养培养基（如SCDAM）上生长。18至24小时分离物用于确定革兰氏反应和菌落形态（例如，杆菌、球菌或酵母）。如果使用16S rRNA测序或MALDI-TOF鉴定属/种水平的分离物，则无需进行细菌革兰氏染色。如果过度热固定、过度脱色或使用培养时间超过24小时会获得不正确的革兰氏染色结果，很可能使用不正确的生化鉴定试剂盒，导致不正确的鉴定。
非芽孢革兰氏阳性杆菌
放线菌属(Actinomyces)、棒状杆菌属（Corynebacterium）、丹毒丝菌属（Erysipelothrix）、李斯特菌属（Listeria）、Cutibacterium和乳酸杆菌属（Lactobacillus）是非芽孢革兰氏阳性杆菌，可在环境样本中分离。放线菌可以从其他非孢子形成的革兰氏阳性杆菌中区分出来，因为革兰氏染色剂在显微镜下会显示一个分支的菌丝网络。此外，放线菌种类可以与琼脂表面上的其他细菌菌落区分开来，因为它们往往非常密集和坚韧。为了推定区分棒状杆菌、Cutibacterium、丹毒丝菌、李斯特菌和乳酸杆菌，可以进行以下生化测试：过氧化氢酶、硫化氢和运动性。棒状杆菌属、Cutibacterium和李斯特菌属为过氧化氢酶阳性，而乳杆菌和丹毒丝菌属为过氧化氢酶阴性。在TSI琼脂上，丹毒丝菌属呈阳性，乳杆菌属呈阴性。棒状杆菌和Cutibacterium是非能动的，而李斯特菌属仅在室温下是能动的（翻滚运动）。利用假定的生化反应将Cutibacterium与其他非芽孢革兰氏阳性杆菌分离是非常困难的。通过使用生化鉴定试剂盒、16S rRNA测序或MALDI-TOF分析，可以在物种水平上鉴定革兰氏阳性杆菌菌株。
革兰氏阳性球菌
放线菌在环境样本中分离革兰氏阳性球菌很常见。过氧化氢酶试验可用于将革兰氏阳性球菌分为两组：过氧化氢酶阳性[葡萄球菌（Staphylococcus）、微球菌（Micrococcus）或考克氏菌（Kocuria）和过氧化氢酶阴性（肠球菌（Enterococcus）、链球菌（Streptococcus）或气球菌（Aerococcus）]。为了将葡萄球菌从微球菌和考克氏菌中区分出来，可以使用溶葡萄球菌酶或杆菌肽敏感性试验。在溶葡萄球菌酶敏感性试验中，葡萄球菌属敏感，而微球菌属和考克氏菌耐受。在杆菌肽敏感性试验中，葡萄球菌属具有耐受性，而微球菌和考克氏菌具有敏感性。用常规的生化方法很难区分考克氏菌和微球菌。因此，这些微生物通常被称为微球菌/考克氏菌。表型鉴定方法无法识别考克氏菌属中的所有成员，因为生物化学和碳同化试验的结果在考克氏菌属的不同物种中显示出异质性。大多数生物化学数据库并不包括所有分类的考克氏菌属物种。目前，考克氏菌属物种的鉴定通常采用16S rRNA测序和MALDI-TOF。凝固酶试验用作推定试验，以确定葡萄球菌分离物是否为金黄色葡萄球菌。然而，现在有七种公认的凝固酶阳性葡萄球菌：Staphylococcusaureus, S.intermedius, S.schleiferi subsp. coagulans, S. hyicus, S. lutrae, S. delphini, 和S. pseudintermedius。此外，现在还发现了凝固酶阴性的金黄色葡萄球菌分离株。不能假设所有凝固酶阳性的革兰氏阳性球菌分离株都是金黄色葡萄球菌，而所有凝固酶阴性的革兰氏阳性球菌分离株都不是金黄色葡萄球菌。建议使用生化鉴定试剂盒、16S rRNA测序或MALDI-TOF将所有的葡萄球菌分离物鉴定到物种水平，而不是使用凝固酶试验。
在环境样本中分离出过氧化氢酶阴性的革兰氏阳性球菌是罕见的，但也可能发生。过氧化氢酶阴性的革兰氏阳性球菌可分离为气球菌、肠球菌和链球菌。由于气球菌类似于血液琼脂平板上的α-溶血性链球菌，因此很难通过推定鉴定，而且仅通过生化检测也很难进行鉴定。推定的生化测试，如视黄素、杆菌肽、6.5% NaCl中的生长、胆汁七叶皂苷水解和马尿酸水解，可用于分离肠球菌和链球菌。为了在属/种水平上鉴定气球菌，建议使用16S rRNA测序或MALDI-TOF。对于肠球菌和链球菌，使用生化鉴定试剂盒、16S rRNA测序或MALDI-TOF。
革兰阴性杆菌
革兰氏阴性杆菌可在环境样品中分离。对于推定的生化测试，氧化酶测试用于确认细胞色素C氧化酶的存在，以区分氧化酶阳性（ox+）和氧化酶阴性（ox-）群的革兰氏阴性杆菌。推定氧化-发酵（O/F）试验可用于确定革兰氏阴性杆菌是否能通过发酵或有氧呼吸（氧化）代谢葡萄糖，从而将氧化酶阳性革兰氏阴性杆菌分离为氧化菌[即假单胞菌(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌（Burkholderia）、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)和栖稻黄色单胞菌(Flavimonas oryzihabitans)]，发酵菌[弧菌(Vibrio)、气单胞菌(Aeromonas)、发光杆菌（Photobacterium）和邻单胞菌属(Plesiomonas)]和阴性菌[产碱菌（Alcaligenes）和莫拉氏菌属(Moraxella)]以及氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌分为氧化菌[即不动杆菌属（Acinetobacter）、浅黄色假单胞菌(Pseudomonas luteola)和嗜麦芽寡养单胞菌(Stentrophomonas maltophilia)和发酵菌（肠杆菌科）]。根据这两项生化推定试验的结果，可使用适当的生化鉴定试剂盒确定属/种水平的分离物鉴定。此外，16S rRNA测序或MALDI-TOF分析也可用于鉴定属/种水平的菌株。
霉菌分离物
在环境样品中分离到霉菌是很常见的。表型和系统发育鉴定方法可用于从物种水平上鉴定霉菌分离物。霉菌的表型鉴定方法如下：宏观和微观特征（传统形态学方法）、Biolog FF MicroPlateTM和MALDI-TOF。传统的形态学方法基于分离物的宏观（群体）特征和微观特征，用于确定属/种的鉴定。关键的宏观特征包括颜色、纹理、反向颜色的使用以及可扩散颜料的存在。关键的微观特征包括菌株的菌丝类型、孢子类型和生殖结构。传统的形态学鉴定方法在鉴定霉菌时通常缺乏特异性，并且可能耗时。根据形态结构，在属/种水平上鉴定霉菌是主观的。Biolog FF MicroPlateTM利用基质氧化产生的显色（四氮唑还原）和真菌生长产生的浊度，提供一种特征反应模式或指纹，用于从物种水平识别霉菌。MALDI-TOF生成霉菌的蛋白质组指纹，用于确定霉菌分离物的物种水平鉴定。但是，MALDI-TOF的商业数据库仍需要改进，因为数据库覆盖率不足。一些研究机构使用内部数据库作为补充。
对于霉菌的系统发育鉴定方法，有两种不同的方法：对大亚基核糖体DNA(D2 LSU）的D2区域进行rDNA测序，以及对一个或两个内部转录间隔区（ITS）进行测序。ITS2比D2扩增片段DNA序列具有更多的变异性，因此提供了更高的特异性，也为真菌鉴定提供了更高的分辨率。在无法使用D2 LSU序列获得物种级鉴定的情况下，通常可以使用ITS测序获得物种级鉴定。一般来说，ITS序列之间的分化程度更高。在某些情况下，单独的D2 LSU测序无法区分不同但密切相关的属，或者无法区分更大范围的密切相关属，ITS测序却可以成功地进行物种级鉴定。
酵母分离物
酵母通常存在于环境样本中，革兰氏染色呈阳性。生化鉴定试剂盒和MALDI-TOF分析等表型方法可用于在属/种水平上鉴定酵母菌株。推定生化试验可用于将酵母分离物鉴定为白色念珠菌：选择性/差异性琼脂，例如铋葡萄糖甘氨酸酵母(BIGGY)琼脂、各种显色琼脂，以及用于检测以下两种酶的存在的快速生化试验：L-脯氨酸氨基肽酶和ß-半乳糖苷酶。大亚基(LSU)D2区和ITS2区的系统发育rDNA测序也可用于确定酵母分离物属/种水平的鉴定。
几个特例
（1）放线菌属、棒杆菌属和Cutibacterium。环境中分离菌，如放线菌属（Actinomyces）、棒杆菌属（Corynebacterium）和Cutibacterium，很难进行革兰氏染色，因为它们的细胞壁在细胞分裂过程中对破裂敏感，导致它们在革兰氏阳性的同时染色革兰氏阴性，结果是革兰氏可变反应。为确认革兰氏可变微生物的革兰氏染色结果，建议进行KOH试验。
（2）芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属。芽孢杆菌和类芽孢杆菌属是内生孢子形成的革兰氏阳性杆菌，是常见的环境分离菌。一般来说，由于难以使用生物化学或系统发育鉴定方法区分该属的某些成员，芽孢杆菌物种无法鉴定到属/种水平。例如，很难基于生物化学方法区分出蜡样芽孢杆菌群的单个成员。此外，基于系统发育方法也很难解决蜡样芽孢杆菌群的鉴定问题。炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的16S rRNA基因序列具有高度的序列相似性（>99%）。在16S rDNA序列上，炭疽杆菌和蜡样芽胞杆菌的某些菌株只有一个核苷酸不同，也有报道称炭疽杆菌的序列与蜡样芽孢杆菌的序列相同。
很难从生化水平上将芽孢杆菌和类杆菌物种彼此分离。可能必须使用16SrDNA基因型和表型鉴定方法的组合来将分离物鉴定为拟杆菌物种。
结 论
有许多不同的方法可用于从属/种水平上鉴定回收的环境微生物分离物，但测序方法（16S rDNA，ITS，全基因组测序）无疑可以提供最精准的鉴定结果。
文献原文链接：
Identificationof Recovered Environmental Microbial Isolates | American Pharmaceutical Review- The Review of American Pharmaceutical Business & Technology
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