突破中和剂限制！科学家打造新型酵母高效绿色合成L-乳酸
发布时间：2025-06-16 浏览次数：28 分享：
在食品、医药、可降解塑料等行业，L-乳酸扮演着关键角色。但传统工艺需加入大量中和剂，不仅成本高，还带来废渣污染。乳酸作为一种关键的生物基化学原料，广泛应用于食品、医药、化妆品及可降解塑料（如聚乳酸PLA）等多个领域。然而，传统微生物发酵在生产L-乳酸过程中，由于微生物对酸性环境耐受性差，乳酸积累会迅速导致pH下降，严重抑制微生物生长，影响发酵效率。为维持发酵平衡，通常需要大量添加中和剂如碳酸钙，不仅提高生产成本，还伴随副产物如硫酸钙的生成，带来环境与资源负担。
近日，江南大学吕雪琴教授团队在《J. Agric. Food Chem.》发表研究成果，成功打造出全球首例在pH 2.6无中和剂条件下高效生产乳酸的酿酒酵母菌株，产量高达76.2 g/L，生产效率刷新纪录！
图1 文献基本信息
图2 图形摘要
在本研究中，为实现基因定点敲除与重组菌株构建，作者首先利用携带Cas9表达框和sgRNA表达盒的PML104质粒构建了酿酒酵母的CRISPR-Cas9系统，同时质粒还包含用于筛选的尿嘧啶选择标记。在该系统中，sgRNA可指导Cas9蛋白在目标DNA上产生双链断裂，随后借助上下游长度为1000 bp的同源臂介导的同源重组机制完成靶基因的敲除或整合。三段所需的DNA片段均通过PCR扩增获得，并在设计时保留有50 bp的重叠序列，以促进DNA片段的重组拼接。线性片段和质粒以2∶1的比例共转化入感受态酿酒酵母细胞，以构建重组菌株。
为了提高酵母菌株对酸性环境的适应能力，作者进一步实施了适应性实验室进化实验。在该过程中，以L-乳酸为选择压力，通过逐步调控酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基的pH值，实现对酵母菌株的选择进化。此外，为实现外源基因的高效表达，作者对目标基因进行了密码子优化。
图3 筛选耐L-乳酸的酿酒酵母底盘菌株
图4 乳酸脱氢酶的筛选
为评估重组酿酒酵母在不同发酵条件下生产 L-乳酸的能力，作者首先在实验室规模下进行了摇瓶发酵实验。具体而言，预培养的酵母种子液在含 3 mL YPD培养基中培养约 20 小时后，接种至 250 mL 厌氧摇瓶中，每瓶含 40 mL YPD培养基，发酵过程在 30℃、220 rpm 条件下进行 48 小时，并采用间歇葡萄糖补料以维持碳源供给。每个菌株均设置三个平行重复，以确保数据的可重复性与统计学稳健性。进一步地，为考察其在放大培养条件下的代谢性能，作者在 5 L 生物反应器中进行了规模化发酵。使用的发酵培养基中包含了大豆蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、KH₂PO₄、MgSO₄、柠檬酸及微量金属元素和维生素，以支持酵母细胞的生长和产酸能力。发酵过程在 30℃、200 rpm、厌氧环境下持续约 36 小时，并通过连续补料的方式将葡萄糖浓度维持在 5 g/L 左右，整个过程中未添加中和剂。
图5 通过“推-拉-抑制”策略提高L-乳酸产量
图6 转运蛋白和辅因子工程进一步提高L-乳酸滴度
为定量分析目的基因的表达水平，研究团队利用荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）技术对关键转录本进行了检测。总RNA提取采用市售RNA提取试剂盒完成，经RT-PCR合成的cDNA用作荧光定量分析模板。qPCR反应体系体积为 20 μL，使用 SYBR Premix Ex Taq 试剂，内参基因为酿酒酵母 18S rDNA，实时荧光检测则在 Roche LightCycler 480 II 系统上进行。发酵产物中 L-乳酸的浓度通过高效液相色谱（HPLC）进行检测。
本研究围绕L-乳酸的绿色生物制造，构建并优化了多种工程化酿酒酵母菌株，实现了在无中和剂条件下的高效发酵生产。通过适应性实验室进化，作者成功获得了能够耐受pH 2.60的工程菌株TMG2，为后续代谢通路的精准重构奠定了稳定的底盘基础。在此基础上，研究团队筛选出高活性的乳酸脱氢酶LLDH，并进一步引入“推—拉—抑制”代谢策略，实现了L-乳酸合成路径的系统优化，其中TMG16菌株的终产物滴度达到了46.8 g/L。
本研究的亮点在于整合长期适应性进化与多层次代谢工程手段，不仅显著提高了菌株对强酸环境的适应能力，也在无中和剂条件下大幅提升了L-乳酸的产量和生产效率，为绿色、可持续的生物制造提供了有效策略。该体系的建立对于减少传统中和剂使用、降低生产成本和减缓环境负担具有重要现实意义。
参考文献：Baoyuan Guo, Wenwen Yu, Xianhao Xu, et al. Adaptively Evolved and Multiplexed Engineered Saccharomyces cerevisiae for Neutralizer-Free Production of L‑Lactic Acid. ACS.jafc.4c12575.DOI:10.1021/acs.jafc.4c12575
来源：微生物安全与健康网，作者~赵瑾。
